kj-1药物化学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,目的,:,促进药物化学的开发和利用,控制天然药物及其制剂的质量,探索天然药物治病的原理,Diseases&Health,中药成分复杂多样,例,:,麻黄,(Ephedra spp.),含,左旋麻黄素,等生物碱以及挥发油,淀粉,树脂,叶绿素,纤维素,草酸钙等,左旋麻黄素,:,平喘,解痉作用,例,:,甘草,(Glycyrrhiza uralensis),含,甘草酸,等皂苷以及黄酮,淀粉,纤维素,草酸钙等,甘草酸,:,抗炎,抗过敏,治疗胃溃疡等作用,第二节 提取分离方法,一 中药有效成分提取,1),提取前查阅文献和药材生药鉴定,2),中药有效成分提取,溶剂法,石油醚可提取油脂,叶绿素,挥发油,游离甾体,氯仿或乙酸乙酯可提取游离生物碱,有机酸,黄酮,香豆素,丙酮,甲醇,乙醇可提取苷类,生物碱盐以及鞣质,水可提取氨基酸,糖类,水蒸气蒸馏法,升华法,液,-,液萃取法,分配比,:,两种相互不能任意混溶的溶剂,置于分液漏斗中充,分振摇,放置后可分成两相,.,如果其中含有溶质,则溶质在,两相中的分配比,K,在一定温度和压力下为一常数,.,K=Cupper/Clower,分离因子,:,表示分离的难易,.,可定义为,a,b,两种溶质在同一,溶剂系统中分配系数的比值,.,=Ka/Kb(,注,:Ka,Kb),100,一次萃取可分离,100,10,萃取,10,次左右,1,时,Ka,Kb,两者性质极其相近,很难分离,分配比与,pH,值,对酸性,碱性及两性有机化合物来说,分配比还受溶剂,系统,pH,值的影响,.,因,pH,值变化可以改变它们的存在,状态,(,游离型和解离型,),从而影响在溶剂系统中的分配比,.,一般,pH12,则恰好相反,.,逆流分溶法,(Countercurrent distribution,CCD),定义,:,也称反流分配法,是一种多次,连续的液液萃取分离过程,.,在多个,分液漏斗中装入固定相,在第一个漏斗中溶入溶质,并加入流动,相溶剂,振摇使两相溶剂充分混合,静止分层后,分出流动相令其,进入第二个试管,再在第一个试管中补充新流动相,再次振摇混合,静止分层,并进行转移,.,如此连续操作溶质即在两相溶剂相对做逆,流移动过程中,不断重新分配而达到分离目的,.,逆流分溶法,优点及适用范围,(1),操作条件温和,(2),样品易回收,(3),适用于中等极性,不稳定物质分离,(4),溶质浓度越低,分离效果越好,(5),不宜采用易于乳化的溶剂萃取单元,(6),样品极性过大或过小不适合采用,CCD,液液分配柱色谱,定义,:,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为,固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶,的另一相作为流动相,冲洗色谱柱,.,物质在两相溶剂相,对做逆流移动中不断进行动态分配而得到分离,.,液滴逆流色谱,(Droplet counter current chromatography,DCCC),原理,:,可使流动相呈液滴形式垂直上升或下降,通过固定,相的液柱,实现物质的逆流色谱分离,.,高速逆流色谱,(High-speed counter-current chromatography),原理,:,是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱，利用,一种单向流体动力学平衡现象，使互不相溶的两个溶剂相在,高速旋转的螺旋管中单向分布。其中一相作为固定相，另一,相作为流动相，利用样品在两相中分配系数的不同实现目标,化合物的分离。,(,三,),根据物质吸附性差别进行分离,吸附色谱法,:,利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离目的的色谱法。,原理,:,吸附剂对不同的化合物表现出程度不同的吸附能力。整个过程中贯穿吸附与解吸附（在一定的溶剂系统中，溶剂与混合物里各组分争夺吸附剂活性表面,),分类,:,(1),物理吸附,:,也叫表面吸附,因构成溶液的分子,(,含溶质,及溶剂,),与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用引起,优点,:,无选择性,吸附与解吸附过程可逆,快速,(2),化学吸附,:,如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附等,具有选择性,过程不可逆,(3),半化学吸附,:,如聚酰胺对黄酮等化合物之间的氢键的,吸附,力量较弱,介于物理吸附和化学吸附之间,物理吸附,物理吸附基本规律,相似者易于吸附,.,固液吸附时,吸附剂,溶质,溶剂三者统一,称为吸附过程中的三要素,吸附剂类型,极性吸附剂,:,硅胶,氧化铝,非极性吸附剂,:,活性碳,极性吸附剂,:,(1),对极性物质具,有较强的亲和能力,故同为溶质,极性强者优先被吸附,(2),溶剂极性越弱,则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力,.,反之,吸附剂对溶质将表现出较弱的吸附能力,(3),溶质即使被,SiO2,Al2O3,吸附,但加入极性强的溶剂时,可被后者置换洗脱出来,非极性吸附剂,如活性炭极性小对非极性化合物的吸附力强,洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性减弱而增强,2.,极性及其强弱判断,概念,:,极性指分子中电荷不对称的程度,官能团的极性强弱,R-COOH,Ar-OH,H2O,R-OH,R-NH2,R-CO-N-R,RCHO,R-CO-R,R-COO-R,R-O-R,R-X,极性,大,小,(2),化合物的极性由分子中所含官能团的种类,数目及,排列方式等决定,(3),溶剂的极性大小,3.,简单吸附法进行物质的浓缩与精制,4.,吸附柱色谱法用于物质的分离,(1),采用硅胶,氧化铝吸附色谱进行分离时,吸附剂的用量,一般为样品量的,30-60,倍,(2),采用硅胶,氧化铝吸附色谱进行分离时,应尽可能选择极性小的溶剂装柱和溶解样品,以利样品在吸附柱上形成较窄的原始谱带,若样品在所装柱溶剂中不易溶解,可将样品用少量极性稍大的溶剂溶解后,用少量吸附剂拌匀,并在,60,度下加热挥尽溶剂,研粉后铺在吸附剂上,(3),洗脱用溶剂的极性应逐步加大,但跳跃不能太大,(4),为避免化学吸附,酸性物质宜用硅胶,碱性物质宜用氧化铝,(5),溶剂系统可通过,TLC,来筛选,薄层色谱,分配系数,分配系数,K,为液液色谱中,两相达到平衡后,某组分在,固定相中的浓度,(Cs),与在流动相中的浓度,(Cm),之比,分离度,(R),是两个相邻斑点的分离程度,以两个相邻斑点中心,距离之差与其平均斑点宽度之比,两个相邻斑点的距离越大,斑点越集中,分离度越大,利用不同物质在相同色谱条件下,产生各自不同的特征色谱行为,(Rf,值或保留时间等,),进行鉴别实验,溶剂前沿,原点,b,a,.,.,.,.,.,W1,W2,d,分离度,岛津,CS-9000,双波长薄层扫描仪,瑞士,CAMAG SCANNER,薄层扫描仪,1,、薄层色谱鉴别法,将固定相涂布于平面的栽板上,流动相通常借毛细管作用流经固定相,使被分离后的物质保留在固定相上,.,特点,:,固定相一次使用,不会被污染,样品预处理简单,对被分离物质性质没有限制,具有多路柱效应,可同时分析大量样品,完成一次分离只需要少量展开剂,固定相和流动相选择范围宽,可定性,定量分析样品,可根据需要制备单一化合物,5.,聚酰胺,-CH2-CO-NH-n,吸附柱色谱,(1),原理,：,属于氢,键吸附,聚酰胺分子中的酰氨羰基与酚类或黄酮类化合物的酚羟基,或酰胺键上的游离氨基与,醌类上的羰基形成氢键缔合而产生吸附,.,(2),影响吸,附强弱的因素,化合物本身对,聚酰胺的亲和力,(a),形成氢键基团数目越多,吸附力越强,(b),氢键位置对吸附力也有影响,易形成分子内氢键者,其在聚酰胺上的吸附相应减弱,(c),分子中芳香化程度高,则吸附性增强,各种溶剂在聚酰胺上的洗脱能力由弱到强,水 甲醇 丙酮,NaOH,水溶液 甲酰胺,二甲基甲酰胺 尿素水溶液,(3),应用,聚酰胺对一般酚类,黄酮类化合物的吸附是,可逆的,(,鞣质例外,),分离效果好,用于植物粗提物的除,鞣质,薄层色谱法和柱色谱,6.,大孔吸附树脂,(1),原理,:,吸附性和分子筛原理相结合的分离,它的吸附性,是由于范德华力引力或产生氢键的结果,分子筛,性是由于其本身多孔性的结构性质决定,(2),影响吸附因素,比表面积,表面电性,能否与化合物形成氢键等是重要的,影响因素,一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附,极性化合物在水中易被极性树脂吸附,化合物的性质也是影响吸附的重要因素,如化合物的分子量,极性,能否形成氢键等都影响其与大孔树脂的吸附,.,分子量小,极性小的化合物与非极性树脂的吸附力强,能与,大孔树脂形成氢键的化合物易被吸附,(3),应用,苷和糖类的分离,生物碱的精制,多糖的分离,黄酮的分离,三萜的分离,(,四,),根据物质分子的大小进行分离,1.,透析法,利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛过滤作用,2.,凝胶过滤,利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛过滤作用,3.,超滤,:,利用因分子大小不同引起的扩散速度的差别,4.,超速离心,:,利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性,适用于水溶性大分子化合物，,如蛋白质、核酸、多糖等的,脱盐精制及分离,(,五,),根据物质解离程度不同的分离法,离子交换法：,以离子交换树脂作为固定相,用水或含水溶剂装柱,.,当样品水溶液通过交换柱时,溶液中的中性分子与离,子交换树脂上的交换基团荷电相同的离子将通过柱,子从柱底流出,而那些与树脂上的交换基团荷电相,反的离子将与树脂上的交换基团进行离子交换并被,吸附在柱上,随后改变条件,并用适当溶剂从柱上洗,脱下来,一、概述,二、提取分离的方法,三、结构研究方法,第三节 结构研究方法,1.,化合物纯度确定,紫外、红外、液相色谱、质谱、核磁等,2.,通过文献调研，理化常数和化学定性分析等初步判断结构类型,3.,由质谱法等确定分子式，分子量,4.,红外光谱进一步推出结构官能团,5.,紫外光谱,6.,核磁,紫外光谱鉴别法,分子中的电子可因光线照射从基态跃迁至激发态。,其中,*,跃迁，,n,*,跃迁可因吸收紫外光及,可见光引起，吸收光谱将出现在光的紫外区及,可见区（,200-700 nm),含有共轭双键、发色团及具有共轭,体系的助色团分子在紫外及可见光,区产生的吸收即由相应的,*,跃,迁，,n,*,跃迁引起。,紫外光谱对于分子中含有含,共轭双键、,，,不饱和羰基（醛、酮、酸、酯,),结构的化合物以及芳香化合物的结构是,一种重要手段。,紫外光谱鉴别法,测定最大吸收波长,测定最大吸收波长和最小吸收波长,测定最大吸收波长和最小吸收波长同时,利用更多的光谱信息,(,如肩峰,),测定吸收系数,测定最大吸收波长及不同波长的吸收值比值,分子中价键的伸缩及弯曲振动将在光,的红外区域，即,4000-625 cm,-1,处引起,吸收。测得的吸收光谱叫红外光谱,（,infrared spectra,IR),红外光谱鉴别法,红外光谱法是一种专属性很强、应用,较广（固体、液体、气体样品）的鉴,别方法。主要用于组分单一、结构明,确的原料药、特别适用于用其他方法,不易区分的同类药物。,高效液相色谱法,原理,:,用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂,缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱中,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器,.,概念,:,保留时间,:,进样点至色谱峰极大点测量所得,理论板数,:,将色谱分离过程看做一系列相继的平衡过程,每一平衡阶段称之为一个理论板,即把色谱柱假想成由许多板组成,在每一板上,成分在两相间建立一次平衡,.,色谱柱的理论板数越,多,柱效越高,分类,正相色谱法,(Normal phase,chromatography,NPC,),色谱系统由极性固定相和非极性流动相组成,反相色谱法,(reverse phase,chromatography,RPC,),色谱系统由非极性固定相和极性流动相组成,适用范围,:,可用于高分子,极性,离子和热不稳定化合物的分离分析,分离度和实验条件,分离度,公式将许多实验变量概括为柱效,色谱保留及选择性三个方面,参数,k,和,由流动相和固定相组成及温度决定,这些条件决定溶质,在流动相和固定相之间的分配平衡,从而影响了色谱保留,柱效,n,取决于色谱柱的质量,随柱条件变化而变化,:,填料粒度,柱长,流动相流速,柱效,色谱保留,选择性,一 溶剂强度的影响,分离度,R,随,k,的增加而增加,当,k,达到,10,以上,继续增加,k,不显著影响,R,而分析时间增加了,最佳的,k,在,2-10,之间,成分的保留可以通过改变流动相的溶剂强度而控制,强溶剂降低保留,而弱溶剂增加保留,二 选择性的影响,当样品所有谱带,k,在,0-20,之间,仍得不到完全分离,应该改变,条件使谱带间的距离或选择性,发生改变,.,通过改变,流动相,柱,填料和温度,来改变,(,一,),改变流动相,表,RPC,中改变流动相以改变选择性,改变项,第一,次,第,二,次,改变,B%,40%,乙腈,4,5,%,乙腈,改变,有机,溶剂,40%,乙腈,50,%,甲醇,混合,有机,溶剂,40%,乙腈,2,0%,乙腈,加,25%,甲醇,改变,pH,pH2.5,pH2.5,溶剂强度对选择性的影响,选择,B%,使,k,在,0.5-20,之间,因而溶剂强度对,的影响,可见,当,B%,改变,5-10%,谱带间的距离也有明显改变,分离度也改善,.,溶剂类型的选择性,改变溶剂的类型是改变选择性的有效方法,通常是改变强溶剂成分,B,优化溶剂类型的选择性,改变溶剂类型常导致带间距离的变化,但有可能使原来分离开的谱带重叠,此时,混合这两种不同类型的溶剂,常可达到好的效果,4.,对离子化合物的选择性,对含离子或可离子化的样品,流动相可通过改变,pH,值,离子对试剂或胺添加剂,缓冲盐或其浓度等进一步改变,选择性,5.,选择性络合作用,在某些情况下加络合剂至流动相以增加选择性,.,如银离子与顺式烯和胺络合,(,二,),改变固定相,色谱柱填料的性质对选择性有很大的影响,(,二,),改变柱温,增加柱温,1,通常降低保留,k,1-2%,同时也改变,三 柱理论板数的影响,增加,n,使所有谱带的分辨率提高,仔细填装柱,用较长柱,较低的流速,较小的柱填料粒度,较低的流动相黏度和较高的柱温,较小的样品分子,最小的柱外效应,四 进样量的影响,对于常规柱,(4-5mm i.d.,150-250mm L),进样量,25ul,和,10 ug,柱过载,随着进样量的增加,峰展宽,板数,n,下降,保留时间下降和分离度变差,可分为,体积过载和质量过载,UV,检测器,光源为氘灯,工作波长为,190-400nm,DAD,检测器,(diode array detector),光源为氘灯,工作波长为,190-400nm,优点,:,可在一次进样后,同时采集不同波长下的色谱图,还可显示任一波长下的色谱图,可提供每一个色谱峰的,UV,光谱,因此有利于选择最佳检测波长,检查色谱峰各个位置的光谱,可评价色谱峰的纯度,检测器,蒸发光散射检测器,Evaporative light scattering,ELSD,原理,:,当柱流出物为高速气流,(,氮气或空气,),雾化后,经蒸发器使流动相蒸发,不挥发的待测成分成为微粒气雾流,用一定强度的入射光,(,激光光源,),准直后照射此雾气流,测定散射光,其强度取决于微粒的大小和数量,也取决于待测成分的浓度,范围,:,通用型检测器,几乎对所有样品成分都有响应,用于在挥发性流动相中测定非挥发性成分,可用于梯度洗脱,现代质谱技术,1.,基本概念,质谱,(mass spectrum,）,:,是样品分子或原子在外部能量的作用下电离或电离后进一步分解而生成的离子，这些离子在质量分析器（电场或磁场）的作用下按照带电粒子的质量对所带电荷之比值（质核比，,m/z,）大小依次排列形成的图谱。,质荷比,:,是离子的质量和该离子所带静电单位数的比值,基峰,:,质谱图中的最强峰,相对强度,:,以基峰的强度为,100,算出各个质谱峰的相对百分强度,分子离子峰,:,是样品分子失去或得到一个电子形成的,质谱仪组成,（,1,）,样品引入系统,：将样品引入离子源；,（,2,）,真空系统,：保证质谱仪中有非常低的压力；,（,3,）,离子源,：电离中性分子；,（,4,）,质量分析器,：提供,m/z,信息；,（,5,）,检测器,：测量离子的相对丰度；（,6,）,电路系统,：控制各部分的操作；（,7,）,数据处理系统,无机质谱,有机质谱,生物质谱,质谱应用领域,气相离子化学,物理化学,有机化学,高分子化学,生物化学,药物化学,天然产物化学,质谱种类,等离子体解析质谱,(PD-MS),快原子轰击质谱,(FAB-MS),电喷雾电离质谱,(ESI),基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（,MALDI-TOF-MS,）,傅立叶变换离子回旋共振质谱法,(FTICR-MS),离子化方式,:,电子轰击离子化,(EI),化学离子化,(CI),激光解吸离子化,(LDI),基质辅助激光解吸离子化,(LDI),大气压离子化,(API),现代质谱联用技术,气相色谱,-,质谱联用,液相色谱,-,质谱联用,毛细管色谱,-,质谱联用,大气压下的液相色谱和质谱的联用接口是利用气体辅助（或加高压）下流动相喷雾，将溶剂挥发除去，同时流动相中的溶质分子在大气压下进行电离。,解决了联用时对液相色谱流动相的限制，检测灵敏度也有了很大的提高。,液相色谱，质谱和串联质谱三者的结合，使样品的分离和结构解析的复杂工作得到简化。,为快速分析中药粗提物提供了一个很好的手段。,