1、基金项目:湖北省技术创新专项(重大项目)()作者简介:何嘉伟(),男,硕士研究生在读,研究方向:中药物质基础及作用机制研究,:通信作者:江汉美(),女,本科,教授,研究方向:中药物质基础及作用机制研究,:顶空气相色谱法分析干姜、细辛及其药对挥发性成分何嘉伟江汉美邸江雪田宇刘天琪黄振阳(湖北中医药大学药学院湖北省药用植物研发中心,武汉,)摘要目的:测定分析比较干姜、细辛及其药对的挥发性成分,为其后续的临床应用提供科学参考。方法:采用顶空固相微萃取 气相色谱 质谱联用()法,对干姜、细辛及其药对挥发性成分进行提取分析,采用单因素考察法确定最优萃取条件,用面积归一化法计算各成分的相对百分含量,并结合
2、主成分分析()。结果:从干姜、细辛及药对中共鉴定出 种成分。其中从干姜中鉴定出 种成分,占挥发性总成分的 ;从细辛中鉴定出 种成分,占挥发性总成分的 ;从药对中鉴定出 种成分,占挥发性总成分的 。组数据的 综合得分差异较大,其中药对得分最高。结论:干姜、细辛及其药对,其挥发性成分及含量均有差异,且两药配伍后产生了新的挥发性成分,因此从挥发性成分变化方面为药对发挥协同增效作用的物质基础研究奠定基础,为其后续药效成分的进一步研究及临床应用提供科学依据。关键词干姜;细辛;药对;顶空固相微萃取;气质联用技术;挥发性成分;主成分分析;配伍 ,(,):(),(),:(),():,;,;,:,();();(
3、);();中图分类号:;文献标识码:中药药对源于中医临床实践,系指两味中药通过相对固定的组合形式形成配伍单位而发挥综合效应,是中药复方“合群妙用”的缩影,体现了方剂配伍的规律特征和辨证施治的科学内涵 。中药干姜来源于姜科植物姜 的干燥根茎,性辛,热,归脾、胃、肾、心、肺经,具有温中散寒、温肺化饮的功效,有解热镇痛、抗炎抑菌、保护心血管等药理作用 。中药细辛来源于马 兜 铃 科 植 物 北 细 辛 ()、汉城细辛()或华细辛()的干燥根和根茎,性辛,温,归肺、肾经,具有解表散寒、祛风止痛、温肺化饮的功效,有解热镇痛、镇静、保护心脑血管系统、抗肿瘤等药理作用;细辛也在国家卫生健康委员会、国家中医药
4、管理局推荐临床治疗新型冠状病毒感染(,)的通用方剂清肺排毒汤中得到合理应用 。,干姜、细辛药对首见于 伤寒论 中的小青龙汤中,可温肺散寒化饮止喘,用于治疗肺寒之诸喘证;临床上主治呼吸系统的疾病如风寒袭肺引起的痰饮、咳喘、鼻塞、慢性阻塞性肺病等病症 。挥发油类物质为干姜、细辛药对的主要有效成分,目前在国内外文献中运用顶空固相微萃取 气相色谱 质谱联用(,)法分析干姜、细辛药对配伍后的挥发性成分尚未见报道。本研究采用 法对比分析干姜、细辛的挥发性成分,为后续其药效成分的深入研究奠定基础,同时进一步考察配伍前后的挥发性成分变化,以期为药对发挥协同增效的物质基础研究和临床应用提供科学依据。仪器与试药
5、药材干姜(湖南松龄堂中药饮片有限公司,批号:),细辛(湖南松龄堂中药饮片有限公司,批号:),经湖北中医药大学杨红兵教授鉴定,分别为姜科植物姜 的干燥根茎和马兜铃科植物华细辛 的干燥根和根茎。将干姜和细辛分别用粉碎机打成粉末并过 目筛,取出备用。仪器手动固相微萃取进样装置(公司,德国,型号:),气相 质谱 计算机联用仪(公 司,美 国,型 号:),电子天平(北京赛多利斯天平有限公司,型号:)。方法与结果 色谱与质谱条件 条件色谱柱:石英毛细管柱(,);载气:高纯度氦气();流速 ;进样口温度:;程序升温:从 开始,以 升 温 至 ;不分流进样。条件 源;离子源温度 ,电离电压 ;四极杆温度 ;扫
6、描质量范围 。顶空固相微萃取条件的优化 取样量的优化分别精密称取药对混合粗粉 、,在 下平衡 ,选用 萃取纤维头萃取 ,按“”项下条件进样测定,以色谱出峰总面积为主要指标,以质谱鉴定出的化合物种类数为辅助指标,对样品取样量进行优化。当取样量为 时,萃取吸附效果最好,故确定 为最佳取样量。萃取温度的优化精密称取药对混合粗粉 ,其他条件不变,分别在 、条件下对混合样品进行萃取,按“”项下条件进样测定和分析。当萃取温度为 时,萃取吸附效果最佳,故确定 为最佳萃取温度。萃取时间的优化精密称取药对混合粗粉 ,在 下加热平衡 ,其他条件不变,选用 聚二甲基硅氧烷(,)二乙烯苯(,)萃取纤维头分别萃取 、,
7、按“”项下条件进样测定和分析。当萃取时间为 时,萃取效果最佳,故确定 为最佳萃取温度。解析时间的优化精密称取药对混合粗粉 ,在 下加热平衡 ,选用 萃取纤维头萃取 ,取出,立即插入色谱仪进样口,分别解析 、,按“”项下条件进样测定和分析。当解析时间为 时,总峰面积最大,故确定 为最佳解析时间。顶空固相微萃取条件 综合“”项的考察结果,最终确定顶空固相微萃取条件的最佳条件为:精密称取药对混合粗粉 ,至于 顶空瓶中,插入装有 萃取纤维头的手动进样器,在 下加热平衡 ,再压缩手柄伸出萃取头萃取 ,取出,立即插入气相色谱仪进样口解析 ,不分流进样。单味药材干姜和细辛的实验条件同上。数据分析采用峰面积归
8、一化法计算各组分相对百分含量,并通过 质谱数据库对所出峰的质谱图进行检索,结合相关文献进行人工谱图解析,并结合相对保留时间以鉴定各组分。实验结果通过 统计软件对干姜、细辛及其药对的挥发性成分及其含量进行主成分分析(,),得到主成分的特征值和贡献率。各特征向量挥发性成分相对含量再通过 标准化后,得到各主成分得分及综合得分。样品测定结果按照上述条件,采用 法对干姜、细辛配伍前后挥发性成分进行检测分析,初步鉴定出了 种化合物,挥发性成分分析结果见表 。干姜、细辛及其药对总离子流见图 。世界中医药 年 月第 卷第 期表 干姜、细辛以及干姜细辛药对挥发性成分分析结果序号保留时间()中文名称英文名称分子式
9、相对百分含量()药对干姜细辛 ()蒎烯()蒎烯 莰烯 ()莰烯()蒎烯 ()蒎烯()亚甲基环己基甲醇()月桂烯 水芹烯 萜品油烯 异丙基 亚甲基 环己烯 桉叶油醇,松油烯 壬酮 异丙烯基甲苯 甲基 (甲基乙烯基)苯,芳樟醇 ()(,)蒿甲醚()(,)()氧化柠檬烯 ,二氢硅烷,异蒲勒醇 ()樟脑 优葛缕酮,莰烯水合物,()异龙脑 冰片()烯丙基苯甲醚 蒈烯 松油醇 异亚丙基双环 辛烷 ()()香茅醇()()香茅油 异丙基 甲氧基 甲基苯 ,二甲基 ,辛二烯 醇,橙花醇 ,二甲氧基甲苯,十一酮 黄樟醚 对甲氧基苯乙酮 乙烯基 甲基 丙 基 丙 烯 基 环己烯()(),二甲基辛 ,二烯(),()荜
10、澄茄油烯()()蒎烯(),二甲基 (甲基 戊烯基)双环 庚 烯 榄香烯 甲基丁香酚 ()金合欢烯 (),二表 雪松烯,石竹烯()香树烯()肉豆蔻醚 ,姜黄烯 ,续表 干姜、细辛以及干姜细辛药对挥发性成分分析结果序号保留时间()中文名称英文名称分子式相对百分含量()药对干姜细辛 正十五烷 ()雪松烯()法呢烯(,)()甲基 (甲基 亚甲基 己烯基)环己烯()倍半水芹烯 ()花柏烯()()长叶蒎烯 甲基十五烷 (),三甲基 ,十二烷三烯 醇 ,(),(亚甲基二氧)苯丙酮 (,)橙花叔醇 榄香素 ,二异丙基 ,环戊二烯,()绿花醇()愈创木烯 芳香树烯 卡枯醇 (,)(,),三甲基 亚甲基 ,八氢
11、苯并 环轮烯 正十七烷 ,二甲氧基苯异氰酸酯,金合欢醇 愈创兰油烃 邻 异丙基苯 己基 苯并咪唑 香叶基芳樟醇 贝壳杉 烯 注:“”表示成分不存在图 干姜、细辛及其药对挥发性成分总离子流注:药对;干姜;细辛 干姜、细辛以及药对的挥发性成分的定量分析从干姜、细辛及其药对中共鉴定出挥发性成分 种。其中从干姜、细辛药对中分离出 个峰,并鉴定出 种成分;从药材干姜中分离出 个峰,并世界中医药 年 月第 卷第 期鉴定出 种成分;从药材细辛中分离出 个峰,并鉴定出 种成分;各成分总量分别占总挥发性成分的 ,和 。见表 ,图 。干姜、细辛药对中挥发性成分含量最高的为(),二表 雪松烯(),其次为 倍半水芹烯
12、()、()花柏烯()、黄樟醚()、香树烯()、甲基丁香酚()、,二 甲 氧 基 甲 苯()、()蒎 烯()等;药材干姜中挥发性成分含量最高的为()雪 松 烯(),其 次 为 姜 黄 烯()、倍半水芹烯()、(甲基 亚甲 基 己 烯 基)环 己 烯()、香 树 烯()、法 呢 烯()、()蒎 烯()等;药材细辛中挥发性成分含量最高的为甲 基 丁 香 酚(),其 次 为 肉 豆 蔻 醚()、正十五烷()、黄樟醚()、,二 甲 氧 基 甲 苯()、()雪 松 烯()、倍 半 水 芹 烯()、卡 枯 醇()等。干姜、细辛及药对的挥发性成分中共有成分和特有成分分析干姜、细辛及药对挥发性成分中有 种共有成
13、分,分别为冰片、,二甲氧基甲苯、黄樟醚、()蒎烯、甲基丁香酚、倍半水芹烯。三者共有成分中()蒎烯和 倍半水芹烯的含量相对于干姜、细辛配伍前上升较为明显;冰片、,二甲氧基甲苯、黄樟醚和甲基丁香酚的含量相对于干姜、细辛配伍前下降。共有成分中部分成分差异较大,如药材细辛中甲基丁香酚的相对含量为 ,而药对和干姜药材中占比分别为 和 ;药对中 倍半水芹烯的相对含量为 ,而干姜和细辛单味药材中占比分别为 和 。将干姜、细辛及药对的挥发性成分进行比较,药对中有 种特有成分,占总挥发性成分含量的 ,主 要 特 有 成 分 有()花 柏 烯()、石竹烯()、橙花树醇()等;干姜中有 种特有成分,占总挥发性成分含
14、量的 ,主要特有成分有 姜黄烯()、法呢烯()、()金合欢烯()等;细辛中有 种特有成分,占总挥发性成分含量的 ,主要特有成分有肉豆蔻醚()、正十五 烷()、,(亚 甲 基 二 氧)苯 丙 酮()等。干姜、细辛及药对挥发性成分种类和含量的差异表 中的挥发性成分大致可分为 类,包括烯类、醇类、醚类、酚类、酮类、芳烃类、烷烃类和其他类化合物。药对挥发性成分中烯类成分相对含量最高为 ;干姜药材挥发性成分中同样也是烯类成分相对含量最高为 ;细辛药材挥发性成分中酚类成分相对含量最高为 ,其次为醚类成分为 。三者的挥发性成分种类和含量的具体信息见表 。表 干姜、细辛以及药对挥发性成分种类和相对含量的分析类
15、别药对数量(个)相对含量()干姜数量(个)相对含量()细辛数量(个)相对含量()烯类 醇类 醚类 酚类 酮类 芳烃类 烷烃类 其他类 干姜、细辛及药对挥发性成分 由表 可知,组样品的挥发性成分含量数据离散,结果显示前 个主成分的初始特征值均 ,其方差贡献率分别为 、,个主成分累计贡献率达到了 ,能够反映样品的整体信息,故取这 个主成分作为数据分析的有效成分。见表。由表 可知,主成分综合评价中,药对与单味药材的评分差异较大,干姜、细辛药对挥发性成分的综合得分较高。表 主成分的特征值及其贡献率主成分初始特征值方差贡献率()累积贡献率()表 干姜、细辛及药对挥发性成分主成分得分和综合得分(分)样品成
16、分 成分 合计药对 干姜 细辛 讨论通过比较分析,药对中的挥发性成分并不是两味药材挥发性成分简单相加,干姜、细辛配伍后产生了许多新的成分且含量较高,同时单味药中有许多挥发性成分在药对中未被检出。结合三者的共有成 ,分推测,干姜、细辛配伍前后挥发性成分变化可能是因为混合药材粉末在高温萃取过程中发生以化学变化为主的一系列反应,导致醚类和酚类物质转变成烯类物质。细辛中含量较高的毒性物质如黄樟醚、肉豆蔻醚、甲基丁香酚等成分在与干姜配伍后含量大幅度减少,提高了用药的安全性 。药对中挥发性成分相对含量上升的 石竹烯具有抗炎抑菌的作用 ;倍半水芹烯具有抗肿瘤的药理作用 ;蒈烯和香树烯具有抑菌的作用 ;橙花叔
17、醇具有抗疟疾、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用 ;()蒎烯具有抗氧化的作用 。根据 结果显示,干姜、细辛药对评分最高。综上所述,干姜、细辛药对的配伍具有协同增效减毒的作用。中药药对研究是阐明中医用药原则的重要途径,干姜、细辛药对是经过长期实践得出的经典药方,临床应用广泛。但是对干姜、细辛药对的挥发性成分研究较少。与传统的水蒸气蒸馏法等提取方法比较,操作更简单、费用低廉且减少了煎煮过程中造成的挥发性成分的流失;通过对数据降维等分析,在中药成分分析鉴定中起到重要作用,将数据进行标准化处理,进而便于对样品间的相似性和差异性进行科学准确的评价,主成分的特征值及方差贡献率是选择主成分的依据。通过 统计软件对
18、组样品的 种挥发性成分及其含量进行 ,对干姜、细辛及其药对的挥发性成分进行综合评价 。本研究首次采用 结合化学计量法对干姜、细辛药对的挥发性成分进行比对分析,既拓展了其药效成分的研究方法,同时也为干姜、细辛药对发挥协同增效的临床应用提供了科学依据。本研究采用 联用分析干姜、细辛药对配伍前后的挥发性成分。共鉴定出 种成分,其中烯类成分占比最大。鉴定出干姜、细辛药对挥发性成分 种,干姜挥发性成分 种,细辛挥发性成分 种,各定性组分分别占总挥发性成分的 ,和 。药对中新增 种成分,包括()花柏烯、石竹烯、蒈烯、()莰烯等。同时,药对与干姜共有的挥发性成分为 种,与细辛共有的挥发性成分为 种,单味药材
19、干姜和细辛共有的挥发性成分为 种,组数据共有成分为 种。利益冲突声明:无。参考文献 顾俊菲,刘培,陶伟伟,等 药对配伍策略及其内在机制研究述评 中华中医药杂志,():亓雪,张颖颖 干姜的化学、药理研究进展 山东化工,():钱深思,刘美怡,容蓉,等 细辛挥发油的化学成分及其药理和毒理现代研究进展 中国药物警戒,():秦子楠,王梦昕,史楠楠,等 基于文献分析的细辛在清肺排毒汤中合理应用 中国中药杂志,():庄星星,陈明,倪受东,等“细辛 干姜”药对在中医方剂中的应用分析 中医药临床杂志,():庄星星,倪受东,陈明,等“细辛 干姜”药对配伍前后指纹图谱变化及其多指标成分的定量分析 中医药临床杂志,(
20、):黄萍,周祯祥,李德顺,等 基于代谢组学和网络药理学探讨细辛干姜药对对 大鼠肺、肝脂质代谢的影响 中国实验方剂学杂志,():张启博 干姜细辛五味汤加减治疗慢性支气管炎急性发作的临床分析 中国处方药,():冯小龙 挥发油类中药主要化学成分安全性预测研究 世界科学技术 中医药现代化,():李艳可 中药材细辛的毒性研究评述 中国民康医学,():,宗时宇,刘洋,孙婷婷,等 细辛毒性及其控制方法研究进展 中国药师,():赵虹霞,邓玲,王萱,等 石竹烯对小鼠脑缺血再灌注损伤作用机制的研究 中国临床药理学杂志,():田宇,江汉美,邸江雪,等 联用分析丁香、肉桂及其药对挥发性成分变化 中国医院药学杂志,():,()():,():张智敏,阚雨村,江豪杰,等 枳壳挥发油抑菌活性的谱效关系 中成药,():罗凡,费学谦,车运舒,等 香叶树挥发油、油脂等主要成分分析 林业科学研究,():张丽丽,马晓琳,王冬,等 高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建 中国中药杂志,():,():刘天琪,江汉美,李书帆 分析山楂及其制品的挥发性成分 现代食品科技,():,刘天琪,江汉美,田宇,等 基于 和 分析知母及其制品的挥发性成分 现代食品科技,():,(收稿本文编辑:吴珊)世界中医药 年 月第 卷第 期