ITC等温滴定量热法的操作说明.ppt

,Page,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,等温滴定量热法,(Isothermal Titration Calorimetry,ITC),2011-10-13,2,Isothermal Titration Calorimetry,ITC,等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化,它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，,原位、在线和无损伤,地同时提供热力学和动力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的,首选,方法。,可获得生物分子相互作用的,完整热力学参数,，包括结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（H）、摩尔结合熵（S）、摩尔恒压热容（Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）,3,独特特点：,它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，,样品用量小，方法灵敏度和精确度高,(,仪器最小可检测热功率,2 nW,，最小可检测热效应,0.125uJ,，生物样品最小用量,0.4ug,，温度范围,2 -80,，滴定池体积,(1.43 ml),。,实验时间较短,(,典型的,ITC,实验只需,30-60,分钟，并加上几分钟的响应时间,),，,操作简单,(,整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由,Origin,软件分析,ITC,得到的数据,),。,测量时不需要制成透明清澈的溶液,而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。,尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程,。,4,Applications include:,Characterization of molecular interactions of small molecules,Lead optimization.,Enzyme kinetics.,Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.,Assessment of biological activity.,5,6,在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。,9,滴定一般在尽可能,接近绝热,的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。,实验数据以,热谱图,形式表示，它提供了有关反应中,物质的量（滴定终点）和反应物质的特性（焓变）,的数据。对图进行分析，可以得知反应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关系，计算反应的热力学量,如平衡常数,K(G),、标准状态下的焓变,H,和熵变,S,这部分内容称为滴定量热法。,测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质,(,如粘度、光学透明度、介电常数、溶剂强度、以及离子强度等,),无关,因此可以用于气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。,10,典型的,ITC,数据,配体溶液,20,次注射到,ITC,池的蛋白溶液中。每个注射峰（上图）下方的区域与注射所释放的总热量相等。当这种,综合的热量相对添加到池中的配体摩尔比,作图时，就获得了相互作用的完整结合等温线（下图）。用单位点模型来验证数据。化学计量、结合常数及焓的数值都显示在框内。,11,12,ITC,法测量结合,/,解离常数,ITC可以直接测量焓变H，结合常数Ka，而不对反应体系产生影响，也不引入修饰基团，因此测得的结果更加可信,13,14,15,（,G,）与总的结合亲和力直接相关，但不能了解结合机理。,ITC,提供了（,G,）以及（,H,）和（,S,），产生了结合机理的真实图像。,作用机理研究与分析开发,16,ITC,：用生物相关模型系统架起桥梁,ITC,的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固定。,ITC,的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。,INS,THANK YOU!,