PCR技术教程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,聚合酶链式反应（,PCR,）原理与相关技术,1,一、,PCR,技术,二、定量,PCR,技术,三、数字,PCR,技术,2,一、,PCR,原理,Polymerase Chain Reaction(PCR),：在体外特异性地扩增某个基因。,1,、历史,1971,年，,Khorana,提出体外人工复制,DNA,的设想。,1985,年,Cetus,公司科学家,K.B.Mullis,使设想变成现,实，采用大肠杆菌,DNA,聚合酶,Klenow,片断（,37,），,并获,1993,年诺贝尔化学奖。,1988,年,R.K.Saiki,应用,Taq,DNA,聚合酶（,水生栖热菌,）,于,PCR,反应；同年，,Cetus,公司发明自动热循环仪。,K.B.Mullis,3,2,、原理,预变性,变性退火延伸,保存,循环（,30,次）,95,预变性,1 min,95,变性,1 min,目的：,DNA,双链成单链,56,退火目的：引物先与模板匹配,72,延伸,1-2,min,目的：聚合酶在引物,3,端加,核苷酸，合成新链,12,保存,循环,特异性强、灵敏度高、快速、简便,4,循环次数,DNA,数量,1,2,2,4,3,8,20,1048576,30,1073741824,5,1,、,Taq,酶,：具有,5,3,聚合酶和外切酶活性，无,3,5,外切酶活性，不,能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：,Mg,2+,2,、,pfu DNA,聚合酶,：有,5,3,和,3,5,外切酶活性，出错率最低，但,PCR,产物平端。,3,、,Taq Plus DNA,聚合酶,：是,Taq,和,pfu,的混合物，,Taq PCR,产物,3,端带,A,。,4,、,引物,：互补；引物长度；,3,碱基序列必须与模板配对；尽量提高,GC,含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引,物二聚体。,5,、,Tm,=(G+C),4+(A+C),2,6,、,primer 5.0,7,、,模板纯度,：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、,DNA,酶、,Mg,2+,螯合剂等。模板量（,100ng/100,l,）,8,、,dNTP,浓度,2.5,mM,each,特殊说明：,6,普通,PCR,RT-PCR,TAIL-PCR,Real-time,PCR,数字,PCR,PCR,类型：,7,普通,PCR,仪,梯度,PCR,仪,原位,PCR,仪,定量,PCR,仪,数字,PCR,仪,8,二、实时荧光定量,PCR,（,Real-time quantification,PCR,）,1,、历史,实时荧光定量,PCR,技术于,1996,年由美国,AppliedBiosystems,公司推出，该技术不仅实现了,PCR,从定性到定量的飞跃，而且与常规,PCR,相比，它的特异性更强、更能有效解决,PCR,污染问题、自动化程度更高等特点。,9,10,原理,：在,PCR,反应体系中加入非特异性的荧光染料（如,SYBR,GREEN 1,）或特异性的荧光探针（如,Taqman,探,针），利用荧光信号累积实时检测整个,PCR,过程，再,通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析,的方法。,也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数,Ct,（,Cycle Threshold,）。,Ct,值的含义：,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,11,1,、荧光探针和荧光染料：,分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。,SYBR,GREEN 1,：结合双链,DNA,小沟后，荧光强度增强，但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。,特别说明：,TaqMan,探针,：寡核苷酸探针，荧光基团连接在,5,端，淬灭基因连在,3,端。,5,端荧光基团吸收能量后转移给临近的,3,端淬灭基团，发生共振能量转移（,FRET,），只要,探针完整,，,能量就会被淬灭,。,12,荧光定量,PCR,的优点,荧光信号的强弱可实时反映,DNA,的扩增；,灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量；,既能用于定性，判断一段,DNA,序列的有无，也可用于定量，确定起始,DNA,拷贝数。,13,一对引物,引物之间一条寡核苷酸，即探针,报告基因与淬灭基团,完整探针，不发光；水解后，发光。,FRET,14,变性（,95,）,退火（,60,）,15,DNA,聚合酶,16,5,3,外切酶活性；可将探针,5,端的荧光基团切割下来。,17,荧光基团游离下来后发光了！,18,19,因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此,发光的强度与目标基因量成正比,。,20,只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。,21,22,随温度升高，,DNA,双螺旋结构降解程度的曲线即,熔解曲线，,可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（,Tm，DNA双链解链50的温度），用这个,特征峰,就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解,。,染料法做，探针法不做,23,不适合染料法,24,25,卤素灯（白光）,26,定量,线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。,27,28,基线,荧光阈值,Ct,值,DNA,0,基线,：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。,实验结束软件自动分析数据，,基线取默认值,3-15,（循环数）。,如果最小的,Ct,值,18,，保持默认；,如果最小的,Ct,值,18,，基线终点改成最小的,Ct,值减,3,，重新分析。,29,荧光阈值,：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。,默认阈值,基线（背景）荧光信号的标准偏差的,10,倍。,30,Ct,值的含义：,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。,DNA,0,：,样本起始,DNA,浓度。,31,32,理论上,PCR,是一个指数增长的过程，但实际的,PCR,扩增曲线并标准的指数曲线，而是,S,形曲线。这是因为随着,PCR,循环的增多，扩增规模迅速增大，,Taq,酶、,dNTP,、引物，甚至,DNA,模板等各种,PCR,因素逐渐不满足要求，,PCR,效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。,33,34,35,绝对,36,37,处理与对照,38,39,定量,PCR,仪特点,，污染机会少,40,定量,PCR,的实验因素,DNA,纯度：,OD,260/,OD,280,=1.8,1.6-2.0,之间,DNA,用量：,0.05-100ng,RNA,纯度：,OD,260,/OD,280,=2.0,cDNA,用量：,1-100ng,总,RNA,反转录的,cDNA,取,1,l,样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。,41,定量,PCR,实验要素：,目标基因：未知样品,生成标准：曲线标准品梯度,监控系统：阳性对照,监控污染：阴性对照,校准生物学误差：管家基因,校准物理误差：参比荧光（,ROX,）,降低其它误差：重复实验,42,ABI,7500,96,孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。,ABI,试剂,ROX,校正物理方面的误差：,枪的误差（如试剂体积）,耗材质量（如管盖厚度、透光性）,仪器稳定性（如孔间、批间温度波动）,43,44,Real-time,PCR,方法的应用,绝对定量（,Absolute,Quantification,）：拷贝数；标准是已知拷,贝数的质粒,DNA,。,相对定量（,Relative,Quantification,）：相对变化量；内标定量。,前提,：目标序列和内参序列的扩增效率接近,100%,且,偏差在,5%,以内。,45,46,47,蛋白互作,48,49,50,51,52,53,三、,54,55,56,57,58,59,60,61,操作流程,62,63,64,65,66,67,68,69,70,我们班上的刘磊同学所拍,71,