PCR引物设计.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,一、PCR引物设计原则,原理,1、引物是否必须是从基因片段起始端开始？,PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核酸片段，使其能有效地扩增目的DNA序列,1,十条PCR引物的设计原则总述,引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。,产物不能形成二级结构。（,如何避免）,引物长度一般在1530碱基之间。（,太长和太短？）,G+C含量在40%60%之间。,碱基要随机分布。,引物,自身,不能有连续4个碱基的互补,。（引物二聚合体）,引物,之间,不能有连续4个碱基的互补。,引物5端可以,修饰,。,引物3端不可修饰。,引物3端要避开密码子的第3位,。,2,1.引物的特异性,引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。,有时由于模板的复杂性而无法判断，但尽量避免和基因内部有过高的同源性,哪些DNA片段可作为模板？GFP在质粒上，和GFP在基因组上？哪个作为模板，更容易得到专一的GFP片段？,3,2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开,二级结构区域,。用有关计算机软件可以预测估计,mRNA的稳定二级结构,，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）,小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功,。,4,3.长度,寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为,2027mer,。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74),不能保证产物的特异性。,5,4.G+C含量,G+C含量一般为40%60%。,其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，,有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳,。,Tm温度过高过低会出现问题,6,5.碱基础随机分布,引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。,尤其3端不应超过3个连续的G或C,，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。,7,6.引物自身,引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引,物自身连续互补碱基不能大于3bp,。,8,7.引物之间,两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于,4个连续碱基的同源性,或互补性。,9,8.引物的3端 引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，引物3端不能发生错配。,10,9.引物的5端,引物的5端限定着,PCR产物的长度,，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。,引物5端修饰包括：,加酶切位点,；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；,引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。,一般引物要引入酶切位点,一般还需要引入保护碱基,11,10.密码子的简并,如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。,引物设计还要结合克隆载体的酶切位点,阅读框架(尤其是要表达时，参考表达载体),引物上是不是一定要设计加上酶切位点，如果没有酶切位点，如何连接到载体上去？,12,13,14,二、引物设计实例,PREMIER5设计引物,题目：设计PCR引物将Tspo基因扩增后，能用双,酶切,连接到pET28a（+）载体上，并要求Tspo基因能完整的表达,15,Tspo基因序列,atgac tcaatcaaat aataccggaa tactggaaaa gtttgtcaat acagtaatgg gggtaaaaac agaaaatcaa caacagcctt caaatacatt aatcgctact,acgcaagcac tggatatcag agcagtttta gtttacaaac tagggactat cttacaaata,gcagctatga tgctggcttt actgggaatg gaaaaattag taatgctgat tgataaaaat,tctcacctgc ccagttggtt tagcacttta ttagctgtat tatttttcgc tttattaagt,attcgttcgc gaattttttc actcttagat aacacccgtt ctcgtaagac ctatgaccag,gtaatcagac caagatgggc acctccacct ttagtatttc ctatagtttg gatgattatt,gcagttttgc gggtaatttc ttccgtatta atttggcagc aaatgcatca ccaattttta,gcactgcctt taattttatt tgtggtgcat ttggctttag gagatacttg gaatacgatt,tttactgtag aacggagatt aggtgcggct gttcctgtgg ttattttagg cccttggtta,tctgctctag tagtgacggc aatttattgg caaactaatc ctgtagcggg aatgattttt,tcgttttctt gtatctggct aactgtggct gctgtattag tatttagaat ttggcaatta,aatggttcag agccattgta tcctttaaaa ctcacaccag tggaaaaata a,16,17,18,确定：,上游引物BamHI，GGATCC,下游引物 Hind I,，AAGCTT,1、先查找序列有哪些酶切位点，确定使用哪几个酶切位点，,酶切位点和阅读框架方向？,19,2、注意克隆的基因阅读框架和载体的阅读框架保持一致，,如果是用pET28b（+），,该怎样调整引物。,20,3、确定引物碱基的个数，3-4个保护碱基，6个碱基的酶切位点，15个碱基序列配对，一共25个左右。,先调整 premer5 的flie 的 preferences 的默认碱基长度,21,4、要设计两条链的引物，Sense链和Anti-Sense链，注意上下游引物：Sense链是上游引物，Anti-Sense链是下游引物（,如何判断,）,22,5、序列前后可以加一下NNNNNN来满足引物长度的需要，特别是酶切位点和保护碱基,Why？,6.选择S链来编辑引物，将酶切位点碱基设计上去，同时根据需要设置保护碱基，同时注意平衡GC含量,23,7.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，调整和编辑引物,24,8.选择A链来编辑引物，则先将浮框拉至最右边，再进行编辑引物,25,9.查看Hairpin、Dimer、FalsePriming、CrossDimer、GC含量等处，反复调整和编辑引物，直至获得满意的结果,以上是模板较单一的基因引物设计方法,26,如果是从基因组上克隆单个基因，则最好能知道基因上下游序列，如克隆,Fremyella diplosiphon,CpeB,上的基因，可以使用引物搜索功能，提高引物设计的准确性,27,