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细胞培养——对实验室的基本要求
细胞培养是⼀种⽆菌技术，要求⼯作环境和条件必须保证⽆微⽣物和不受其他有害因素的影响。为防⽌微⽣物污染和有 害因素的影响，细胞培养室要求环境清洁，空⽓清新、⼲燥、⽆尘。

细胞培养实验室由⽆菌操作区、孵育区、制备区、储藏区、清洗和消毒灭菌区6部分组成，这些区域的共同特点是房间 要宽敞、明亮，地⾯要便于清洁、防滑，墙壁的质地光滑坚硬，仪器设备布局合理，⽅便操作，避免交叉⼲扰，陈设简 洁，便于清扫。

⼀、⽆菌操作区

⽆菌操作区是只限于细胞培养及其他⽆菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿⾏或受其他⼲扰。在⼀般环境的空⽓ 中，由于存在许多尘埃和杂菌，较易造成污染。

因此，接种⼯作要在空⽓经过灭菌的环境⾥进⾏，⼩规模的⽆菌环境可利⽤超净⼯作台创造，⼤规模的需建⽆菌室。 理想的⽆菌操作室应划为三部分：
1. 更⾐室―供更换⾐服、鞋⼦及穿戴帽⼦和⼝罩。

2.缓冲间―位于更⾐间与操作间之间，⽤于准备⼯作，还有防⽌污染的作⽤，以保证操作间的⽆菌环境，同时可放置恒 温培养箱以及必需的⼩型仪器。

3.⽆菌操作间―⽆菌操作间则专⽤于⽆菌操作、细胞培养，其⼤⼩要适当，且其顶部不宜过⾼以保证紫外线的灭菌效 果；墙壁光滑⽆死⾓以便清洗和消毒，⽆菌操作间容积⼩且为密闭式，⼀般⽆菌操作间的空⽓消毒⽤紫外线灯，有的实 验室使⽤⽆臭氧紫外线消毒器或电⼦消毒灭菌器。

净化⼯作台：操作简单，安装⽅便，占⽤空间⼩且净化效果很好。⼀般细菌培养室使⽤的净化⼯作台主要有两种：

(1)侧流式或称垂直式。
(2)外流式或称⽔平层流式。

⼆、孵育区

孵育区也称培养区，本区对⽆菌的要求虽不⽐⽆菌区严格，但仍需清洁⽆尘，因此也应设置在⼲扰少⽽⾮来往穿⾏的区 域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进⾏，后者费⽤⾼，⼀般实验室多采⽤孵箱进⾏⼯作。

三、制备区

制备区主要进⾏培养液及有关培养⽤的液体等的制备。应设有试剂柜、器械柜、实验台和上⽔道、电源等，配备的主要 仪器设备有⽔纯化装置、天平、微波炉、 pH计、抽⽓泵、电炉、培养分装器、各种规格的培养瓶、培养⽫、移液管、 烧杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、 pH计、磁⼒拌器等设备下完成制备以后，应在⽆菌操作台进⾏过滤除菌。液体制备直接关系组织细胞养的 成败，因此必须严格⽆菌操作。

四、储藏区

储藏区主要存放各类冰箱、⼲燥箱、液氮罐、⽆菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁⽆尘。为了保存细胞，特别是 不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度⼀般为液氮温度-196℃。

细胞的冻存过程需要⼀系列程序降温，⼀般为4 ℃下存放30min。转放-20 ℃ 1 h，再转⼊-80—-70℃过夜，之后才可以 转移到液氮内(-196℃)。因此储存区必须配备冰箱、低温冰箱、超低温冰箱和液氮罐等设备。

五、清洗和消毒灭菌区

五、清洗和消毒灭菌区

清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进⾏所有细胞培养器⽫的清洗、准备、消毒及三蒸⽔制备等⼯作，应备有⾼ 压蒸汽灭菌锅、细菌过滤设备、电热⼲燥箱、消毒柜、排风设备等。

六、细胞实验室的建设要求
1.环境要求

温度：仪器还是操作对温度没有特殊要求，维持舒适的温度即可，⽐如18~26度。
湿度：过⾼的湿度会导致微⽣物的滋⽣，所以建议正常维持湿度在70%以下。

洁净度：细胞实验对洁净区并没有要求，细胞实验⾥⾯只有细胞操作的时候要求⽆菌的环境，这时要求有局部的百级， 通常可以利⽤超净台或者⽣物安全柜来实现，不过有时候为了有个更好⼀点的环境，减⼩超净台过滤器更换的时间，会 维持室内的洁净度，⽐如万级的洁净度。

⽆菌⽆毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的⾸要条件。细胞培养对⽆菌环境要求很⾼，在细胞操作 时，⼀般需要在100级空⽓质量条件下进⾏。

在体外培养的细胞由于缺乏对微⽣物和有毒物的防御能⼒，⼀旦被微⽣物或有毒物质污染，或者⾃⾝代谢物质积累，可 导致细胞中毒死亡。

照明：满⾜实验⽤的操作照度，通常在300LUX。
2.围护结构要求

虽然实验的操作对⼤环境没有特殊要求，不过最好能有不产尘、不积尘的环境，能保证室内的清洁，并且易于清洗、不 容易滋⽣微⽣物，所以在选择维护结构时，选⽤彩钢板、医疗板等洁净板材是⽐较好的选择，为了保证室内的通透性， 可以布置密闭窗。

3.消毒

通常做完实验后，都需要做终末消毒，室内需要安装紫外灯，利⽤紫外灯对空⽓和表⾯消毒。

在细胞培养过程中，⽀原体感染发⽣率达到63%，因⽽细胞培养过程中被⽀原体污染是⼀个世界性的难题。细胞培养中 常遇见的有细菌污染、真菌污染、⽀原体污染、病毒污染等。说起⽀原体污染，估计细胞培养的同学就开始犯愁了，细 胞培养的⽼⼿都知道，⽀原体污染⾮常不易察觉。有的实验室被⽀原体污染后，如果不进⾏有效彻底的⽀原体清除，该 实验的细胞培养很难进⾏下去，细胞传代3代以后状态就急剧下滑，⽆法进⾏正常实验，有的实验室甚⾄只能指望换细 胞间。那么怎样才能有效检测并清除⽀原体污染呢?

德国MB⽣产的Mycoplasma-offTM喷雾剂，或湿⼱擦拭 5-10分钟清除，对⽀原体、细菌、真菌、霉菌、孢⼦祛除确切有 效。⽆残留, ⽆腐蚀 , ⽆致癌性，操作简单⽅便。

qPCR法介绍：

荧光定量PCR法(qPCR)：是在常规PCR基础上，将『针对⽀原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩
增后的产物带有荧光，利⽤荧光信号的变化和配套软件，进⾏DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点： ①灵敏度⾼、特异性强。
②时间短， 2-3⼩时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点： ①对于已做⽀原体灭活处理的样品，由于⽀原体DNA仍旧存在其中， PCR结果会出现假阳性。(可⽤培养法做补 充验证) ②不同⼚家⽣产的试剂盒质量差异巨⼤(由于引物及内在设计不同)，需谨慎选择，尽量在专业⼈员推荐指导下使⽤。