酵母双杂交自激活现象.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酵母双杂交自激活现象,1,真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域,(domain),组成的。,一、原理,酵母的转录激活因子,GAL4,，在,N,端有一个由,147,个氨基酸组成的,DNA,结合域,(DNA binding domain,BD,),，,C,端有一个由,113,个氨基酸组成的,转录激活域,(transcription activation domain,AD,),。,2,GAL4,分子的,BD,可以同上游激活序列,(upstream activating sequence,UAS),结合。,AD,则能激活,UAS,下游的基因进行转录。,单独的,BD,和,AD,都不能激活,UAS,的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。,3,4,5,His,-gal,6,一般情况下，单独的,BD,可以与,GAL4,上游活化序列（,GAL UAS,）结合，但不能引起转录。然而，将一段,具有转录激活活性,的转录因子基因构建到,BD,载体上，若其表达产生的,BD,单独与,UAS,结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的,自激活现象,。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。,7,His,-gal,自激活原理,Transcription factors,GAL4BD,8,YPDA,培养基,0.2g ade,定容至,100ml,0.2%,的,ade,母液,pH 6.5,灭菌,121,15min,9,正对照：,pGAL4,负对照：,pBD-GAL4,10,将,-70,下冻存的酵母菌在,YPAD,平板上划线，倒置于,30,培养,2-3,天。,挑取,2-4,个大菌落（直径,2-3mm,）于,1.5ml YPAD,液体培养基中，剧烈震荡,5min,，,打散菌落,，接种于,50ml YPAD,液体培养基中（,250ml,三角瓶），,230-250,转,/min,，,30,培养,18-24hr,。,取菌液测定其,OD,600,值，,需达到,1.5,。若不到，再培养,12hr,，若还不到，换单克隆重摇。,取,50ml,菌液于,300mlYPAD,培养基中（,1-2L,大三角瓶），,30,，,230rpm,，摇培,3hr,，至,OD,600,值为,0.40.6,。,4000rpm 5min,于常温收集菌体，重复一次。,室温下,1000g,离心,5min,，去上清，加入,50ml,超纯水清洗悬浮,3,次。,1000g,离心,5min,，弃上清，用新配的,1.5ml 1TE/LiAc,重悬细胞，置冰上，即成为酵母感受态细胞。,（只能,现做现用,，不能贮存，室温只能放置,1-2hr,）。,酵母菌株感受态细胞制备：,11,酵母转化,鲑鱼精,DNA,（,20,g/,l,）沸水中煮,20min,，冰上冷却,10min,。,加入,100l,酵母感受态细胞、,12l,构建质粒（,约,200ng,）、,100g,鲑鱼精、,600l TE-LiAc-PEG,，变速涡旋,10s1min,至混匀,。,30,，,200rpm/min,，恒温摇床振荡,30min,。,加入,70l DMSO,，,温和,颠倒混匀。,42,水浴热休克,15min,，后冰浴,10min,。,常温下，,3000rpm,离心,10s,；弃上清（,去干净,），用,0.5ml 1TE,重悬细胞。（,1TE,室温只能放置,12hr,）,将转化后的酵母培养于,SD/-Trp,培养基上，,30,倒置培养约,3-5,天，直至出现菌落。,12,阳性克隆的筛选：,将在,SD/-Trp,培养基上长出的酵母菌落转移到,SD/-His,培养基上进行筛选。,30,培养,2,天，检查生长情况。,对生长状态较好的单克隆进行,-,半乳糖苷酶活性分析。,13,-,半乳糖苷酶活性分析,（酵母克隆滤纸显色分析）,取,2ml,的,Z,缓冲液,/X-gal,溶液润透,2,张滤纸；,小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（,1min,）；,用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸，沾有菌的面朝上置液氮中,10s,，夹出滤纸，室温解冻；重复,3,次；,沾有菌的面朝上，紧贴于预先用,Z,缓冲液,/X-gal,溶液润透过的那张滤纸上，同时吸掉多余的,Z,缓冲液,/X-gal,溶液；,沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于,30,温箱,3-8h,，观察酵母的颜色变化。,14,15,