奶粉中双氰胺的检测方法HPLCUV和HPLCMSMS法.doc

奶粉中双氰胺检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

北京时间1月25日凌晨消息, 新西兰牛奶中发觉了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺, 缩写DICY或DCD。即使国际标准未对食品中双氰胺限量, 但高剂量双氰胺对人体是有毒。
本文采取 Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管和Venusil® HILIC液相色谱柱, 建立了奶粉中双氰胺MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
1 试验部分
1.1 仪器、 试剂与材料
高效液相色谱仪, 涡旋振荡器, 超声波清洗机, 氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS: 461-58-5; FW=84.08）, Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管, Venusil® HILIC液相色谱柱, 微孔滤膜, 乙酸铵、 乙酸、 乙腈为色谱纯, 试验用水为超纯水。

图1双氰胺分子式
1.2 试验步骤
提取、 净化: 称取1g试样于50mL具塞离心管中, 加入2mL水溶解后, 加乙腈定容至10mL, 超声10min, 8000r/min离心5min, 取2mL上清液加入Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管填料, 涡旋0.5min, 8000r/min离心5min, 取上清液过0.22µm滤膜, 待测。
1.3　试验条件
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）:
色谱柱: Venusil® HILIC（5μm, 100Å, 4.6*250mm）;
流动相: 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）: 乙腈=10: 90;
波长: 220nm; 进样量: 10µl; 柱温: 30℃; 流速: 1mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS法:
（1）色谱条件:
色谱柱: Venusil® HILIC（ 5μm, 100Å, 2.1*150mm）;
流动相: 0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）: 乙腈=10:90; 进样量: 10µL; 柱温: 30℃; 流速: 0.2 mL/min。
（2）质谱条件:
质谱仪: API 4000+; 离子源: 电喷雾离子源; 扫描方法: 正离子扫描; 检测方法: 多反应监测; CAD: 8.00; CUR: 10.00; GS1: 60.00; GS2: 50.00; IS: 5500.00; TEM: 500.00。
表1双氰胺质谱信息
药品名称
监测离子对
DP
EP
CE
CXP
双氰胺
85.1/68.1
71
10
41
6

85.1/43.1
71
10
41
6
注: 带“____”监测离子对为定量离子对。
2 结果与讨论
2.1 高效液相色谱法:
2.1.1线性关系和检出限
正确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 作为标准贮备液;
分别量取一定量标准贮备液, 用乙腈稀释, 配置成浓度为0.1µg/mL, 0.5µg/mL, 1.0µg/mL, 2.0µg/mL, 5.0µg/mL和10.0µg/mL标准溶液, 根据上述色谱条件, 依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见表2:
表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）
名称
保留时间
线性方程
相关系数
最低定量限（S/N=10）
双氰胺
4.92min
Y=116.44X+3.2699
0.9997
0.1µg/ml
2.1.2检测方法稳定性考察
选择10.0µg/mL标准溶液连续进样6针, 计算其保留时间和峰面积RSD值, 结果见表3:
表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）
标号
保留时间/ min
峰面积
1
4.930
1061.7
2
4.933
1072.2
3
4.930
1064.4
4
4.929
1079.7
5
4.930
1067.3
6
4.934
1073.6
RSD, %
0.04
0.62

图2 双氰胺0.5µg/mL标准溶液谱图（HPLC）图3 定性定量稳定性考察谱图（HPLC法）
2.1.3正确度和精密度
选择市售某品牌奶粉试样, 进行添加回收试验, 结果见表4
表4 10µg/g添加回收试验结果（HPLC法）
平行1, %
平行2, %
平行3, %
平均值, %
RSD, %
98.6
88.4
89.8
92.3
5.99

图4 奶粉空白谱图（HPLC法） 图5 奶粉10µg/g添加水平谱图（HPLC法）
2.2 LC-MS/MS法
2.2.1线性关系和检出限
正确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中, 加水溶液并稀释至刻度, 作为标准贮备液。
分别量取一定量标准贮备液, 用乙腈稀释, 配置成浓度为5ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 50ng/mL, 100ng/mL和500ng/mL标准溶液, 根据上述液质方法, 依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 拟合线性方程, 结果见下表5:
表5 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）
名称
保留时间
线性方程
相关系数
最低定量限（S/N=10）
双氰胺
3.15min
Y=8777.2X+7435.9
0.9993
5ng/mL
2.2.2 检测方法稳定性考察
选择50.0ng/mL标准溶液连续进样6针, 计算其保留时间和峰面积RSD值, 结果见表6:
表6 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）
标号
保留时间, min
峰面积
1
3.29
382950
2
3.30
387950
3
3.25
382840
4
3.31
399820
5
3.30
378580
6
3.30
383810
RSD, %
0.65
1.92
2.2.3正确度和精密度
选择市售某品牌奶粉试样, 进行添加回收试验, 结果见表7。采取空白样品稀释法判定检测方法基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释标准溶液, 双氰胺峰面积和相对丰度比无显著改变, 故判定该方法无基质效应影响。
表7 100ng/g添加回收试验结果
平行1
平行2
平行3
平均值
RSD
84.6%
80.7%
90.2%
85.2%
5.61%

图 6 10ng/mL双氰胺标准溶液质谱图 图7 奶粉空白质谱图