高效液相色谱的原理与构造.pptx
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1、第三讲 高效液相色谱(HPLC)的原理与构造陆跃乐浙江工业大学 发酵工程研究所内容概要一、高效液相色谱简介二、高效液相色谱的固定相和流动相三、高效液相色谱分离公式与术语四、液相色谱仪的基本配置五、检测器的种类和用途六、色谱柱简介2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所2一、一、什么是什么是HPLC?高效液相色谱:HPLC(High Performance Liquid Chromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效 能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵 敏度检测器广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品,农业无论在技术上,理论上,还是在
2、应用上仍有较大的 发展空间:超高压液相色谱(UPLC)的创立2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所3高效液相色谱的流程2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所4二、高效液二、高效液相色相色谱固定相和流固定相和流动相相2.1固定相的种固定相的种类:1.液-液分配及离子对分离固定相 (1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采用100m的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多见;现采用10m以下的小颗粒,化学键合制备柱填料;(2)表面多孔型担体 (薄壳型微珠担体)3040m的玻璃微球,表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小,柱容量底;2024/
3、4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所5 (3)化学键合固定相 化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相;a.硅氧碳键型:SiOC b.硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广;c.硅碳键型:SiC d.硅氮键型:SiN2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所6化学化学键合固定相的合固定相的特点:特点:(1)传质快,表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快;(2)寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击;耐水、耐光、耐有机溶剂,稳定;(4)选择性好,可键合不同官能团,提高选择性;(5)有利于梯度洗脱;存在着双重分离机制:(键合基团的覆盖率决定分离机
4、理)高覆盖率:分配为主;低覆盖率:吸附为主;2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所7 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类:硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等;结构类型:全多孔型和薄壳型;粒度:510 m;2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所83.3.离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别:(1)薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体,表面涂约1%的离子交换树脂;(2)离子交换键合固定相 薄壳键合型;微粒硅胶键合型(键合离子交换基团)树脂类别:(1)阳离子交换树脂(强酸性、弱酸性)(2)阴离子交换树脂(强碱性、弱碱性)2024/4/2 周二浙
5、江工业大学 发酵工程研究所9 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相(1)软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构;水为流动相。适用于常压排阻分离。(2)半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物,有机凝胶;非极性有机溶剂为流动相,不能用丙酮、乙醇等极性溶剂(3)硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等;化学稳定性、热稳定性好、机械强度大,流动相性质影响小,可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球,具有恒定孔径和窄粒度分布。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所102.2 液液相色相色谱的的流流动相相 1.流动相的特性 (1)液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。流动相组成改变,极性
6、改变,可显著改变组分分离状况;(2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正相柱。(3)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所112.2.流动相类别流动相类别按流动相组成分:单组分和多组分;按极性分:极性、弱极性、非极性;按使用方式分:固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。202
7、4/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所123.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时,溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时:首先选择中等极性溶剂,若组分的保留时间太短,降低溶剂极性,反之增加。也可在低极性溶剂中,逐渐增加其中的极性溶剂,使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序:水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所134.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题2024/4/2 周二
8、(1)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。(2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。(3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并在柱中沉积。(4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时,流动相不应有紫外吸收。浙江工业大学 发酵工程研究所142.3 HPLC分分类n按流动相和固定相的相对极性分:正相色谱(Normal Phase Chromatography)固定相的极性大于流动相反相色谱(Reversed Phase Chromatography)固定相的极性小于流动相n
9、有机化合物的极性:分子间作用力(静电引力,偶极力,色散力,氢键力)综合表现的一种描述。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所152.4 HPLC的基本的基本类型:型:n等度:吸光度相同;在整个运行过程中溶剂组成保持不变 (60:40 甲醇/水)2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所16n梯度:在运行过程中溶剂组成变化;渐变或台阶式变化。100%H20/0%MeOH 到0%H2O/100%MeOH2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所17三、三、HPLC分离公式与分离公式与术语n色谱图:样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称 色谱流出曲线(elu
10、tion profile)。n这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图,这张色谱图含有丰富的信息,现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所18n基线(base line)经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。n噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所19n漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固
11、定相不断被洗脱下来也会产生漂移。n色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所20n峰底基线上峰的起点至终点的距离。n峰高(peak height,h)峰的最高点至峰底的距离。n峰宽(peak width,W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。n半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)峰高一半处的峰宽。2
12、024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所21n峰面积(peak area,A)峰与峰底所包围的面积。洗脱体积(V)和峰宽(W):洗脱体积也可按保留时间表示,记作t。2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所22分离度(R):分离程度的度量n简单来说,分离度即为两峰相对于其峰宽分开得有多远。n分离度大于1.5视作完全分离。时间 0.5 1 2 5 2024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所23保留因子(k):保留能力的量度nk是样品与填料作用强度的直接量度。0.5 1 2 52024/4/2 周二浙江工业大学 发酵工程研究所24分离因子():峰分离程度的量度n是两个化合物
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