马铃薯花叶病.doc

一 马铃薯花叶病的表现
1 叶病包括4种病毒:1925年发现的马铃薯X病毒(PVX)、1952年发现的马铃薯S病
毒(PVS)、1932年鉴定的马铃薯A病毒(PVA)及1931年记载的马铃薯Y病毒(PVY)。
（1）马铃薯X病毒 (Potato virus X 简称PVX)在马铃薯上引起轻花叶症，有时产生斑驳或环斑，病毒粒体线形，长480一580纳米，其寄主范围广，系统侵染的植物主要是茄科，病毒稀释限点100000~1000000倍，钝化温度68一75C，体外存活期l年以上。导致的症状不同，通常的症状为轻型斑驳花叶，叶片颜色深浅不一，小叶片上叶脉间产生黄色嵌斑，严重时还会产生植株顶端坏死、叶片皱缩，植株矮化。通常引起花叶,伴有矮化症状,大田可见顶花叶和系统花叶,叶片局部浓绿或叶脉坏死,叶片变窄,叶上部畸形等".

（2）马铃薯S病毒 (Potato virusS 简称PVS)，在马铃薯上引起轻度皱缩花叶或不显症，多数品种上引起叶脉颜色变深、下陷，叶片粗缩，叶尖下卷，叶色变浅；有的品种感病后产生轻度斑驳、脉带；有的易感品种在感病后期叶片变成古铜色，严重皱缩，叶面产生小的坏死斑病毒粒体线形，长650纳米，其寄主范围较窄，系统侵染的植物仅限于茄科的少数植物，病汁液稀释限点1一10倍，钝化温度55一60C，体外存活期3一4天。目前主要根据在鉴别寄主昆诺黎上引起的症状不同,把Pvs分为2个株系,即Pvso(ordinarystrain)和PvsA(Andean
Strain)[4.]"前者在昆诺黎上引起局部坏死斑,后者引起系统斑驳症状"这2个株系在马铃薯上引起的症状也不尽相同,前者单独侵染通常为隐症带毒,后者常常导致叶片青铜色,并伴有坏死斑点"

（3)马铃薯A病毒 (PotatovirusA简称PVA)病毒浸染植株后，叶片扭曲，叶间出现黄色斑驳，后期叶脉下陷，叶边缘粗缩,在马铃薯上引起轻花叶或不显症病毒粒体线形，长730纳米，其寄主范围较窄，仅侵染茄科少数植物，病汁液稀释限点10倍，钝化温度44~52C，体外存活期12一18小时。PVA单独浸染常引起花叶或皱叶,有时无症状 .马铃薯 A 病毒（PVA）一般会在马铃薯叶片上引起轻度花叶，在叶脉上或叶脉间会呈现出不规则的浅色斑，暗色部分比健叶颜色深，叶子表面粗糙，叶缘可产生皱褶呈波状，在有的栽培品种上可表现不同程度的卷曲和皱缩。病株的茎枝向外弯曲，常呈开散状。

(4) 马铃薯Y病毒 (potato virus Y 简称PVY)，PVY是一种很典型的RNA病毒在马铃薯上引起严重花叶或坏死斑和坏死条斑，病毒粒体线形，长730纳米，该病毒寄主范围较广，可侵染茄科多种植物，病汁液稀释限点100一1000倍，钝化温度52一62C，体外存活期1~2天，这种病毒引起的马铃薯病,一般分为马铃薯重花叶病、条斑垂叶坏死病、条斑花叶病条斑花叶病、点条斑花叶病.PVY具有PVY0株系(普通株系)、PVYc株系(条痕花样株系)、PVYN株系(烟草叶脉坏死株系)等多个不同特性的变异株系.依据血清学反应,PVY分成PVY OC血清型和PVYN血清型; PVY粒子为弯曲的线条状粒子,通常长约700一900nm,直径11一15nm,大小为730x11nm螺旋对称,螺距3.4nm,颗粒含有大约5%的核酸和95%的蛋白质"沉降为单一组分,沉降系数约150s在cscl中浮力密度为1.31g.cm一3"致死温度52一55e,体外保毒期2一3d,稀释终点10一4--10一5
二 马铃薯病毒检测技术
1 指示植物法
1 病毒名称 接种方式 指示植物及其症状
（1）PVX 汁液摩擦 (1) 千日红：接种5-7天后叶片出现紫红环枯斑
(2)千日红对马铃薯x病毒的反应是接种后在叶片上出现红 色病斑
(3) 白花刺果曼陀罗：接种10天后系统花叶
(4) 指尖椒：接种10-12天后叶片出现褐坏死斑点，以后系统花叶
（2）PVY 汁液摩擦 (1) 枸杞：接种10天后接种叶片出现不清晰的褐色局部病斑
( 2)马铃薯A6：接种5-10天接种叶片出现褐色环状枯斑，初 侵染呈绿环斑
(3) 洋酸浆对马铃薯Y病毒的反应是接种后在叶片上出现小枯斑

（3）PVS 汁液摩擦 德伯尼烟：初期明脉，以后系统绿块斑花叶

（4） PVA 地霉松对马铃薯A病毒的反应是在叶片上出现许多小型点状病斑

2 电子显微镜技术

3双抗体夹心酶联免疫吸附法 在酶联反应板的每个孔中加入100ul稀释好的包被液(在每10 mL包被缓冲液中加入35ul待测病毒抗体), 37摄氏温度育3~4 h,或室温 孵育5h,取待测样品约0. 5 g放入样品袋中,加入2. 0 mL提取缓冲液,研磨样品至完全磨碎。将包被好的反应板洗涤后每孔加入100ul样品液。密封后将其放入4 摄氏温度冰箱孵育过夜。反应板经洗涤后每孔加入90ul已稀释的酶标液(每10 mL包被缓冲液中加入35Ll待测病毒对应的酶标抗体), 37摄氏温度 育3~4 h,或室温下5 h洗板后每孔中加入80ul的底物溶液, 30 min左右观察结果并用酶联免疫吸附检测仪读出数据。

二 马铃薯花叶病的取样
匀桨法,称取病叶l克加PB缓冲液(O.IM磷酸缓冲液PH7.0)lml,匀浆,8000转/分离心10分钟,取上清即为病毒悬液,病毒悬液再用PB缓冲液分别稀释成10-1,10-2 ......10-5,备用.

马铃薯 X 病毒的毒源分离、繁殖和提纯用一皱缩花叶症状的东农 303 马铃薯檀株作为
接种体，摩擦接种于 白花 刺果 蔓陀 萝 (D atura stra—m onism )，以 排 除 Y 病 毒，然 后 接 种 于 千 日红G om phrena globosa)T_进行两次单斑分离 ，再接种于 普 通烟 (N ieotiana tabagurll e'4．H um g M iao Y u)上繁 殖 病 毒 ，K hurana 等 的方法 ，称取冷冻毒 源叶片300 g ，以B eckan O ptima LE 一8OK 型 超速离 心机提 纯病 毒 ，用 O．2 M 磷酸氢二钠，0 ．05 M 柠檬酸三钠缓冲液(内含 O．1％二 乙基二硫代氨基 甲酸钠和 O．5％巯基乙醇) 匀浆毒源叶 片，用 7 ％正丁醇 澄清提取液 ，先用聚 乙二 醇 6000 沉 淀一次病毒 ，然后 以 10000d ra in 离心 90 m in 沉淀病毒 ，再以 10％- 40 ％蔗糖密度梯度，28000 r／m in 离心90 m in，用260nm 监测 ，分部收集病毒带 ，然后台并病毒带加进一倍缓冲液 ，用 45000 r／m in 离心 90 m in 回收病毒。
三 马铃薯花叶病病原培养基的制备

四 马铃薯花叶病病原的理化性质的鉴定
2 血清学检测
对待测样品进行DAS一ELISA检测,结果表 明马铃薯 PVX 可与PVX抗血清产生明显的阳性反应。
图PvX病毒粒体

表 :各标样血清学反应及粒体形态

2 免疫学检测技术

(.1)双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS一ELISA)
DAS一ELISA是:一种传统的植物检测技术,在马铃薯病毒检测中有其独到的应用最早是由clark和AdnlnS1977年提出的,现在被普遍应用于各种植物的病毒检测"为了加快反应速度,节省时间,白艳菊等在常规DAS一ELISA方法基础上做了两方面的改进:第一,由常规ELISA在一块板上一种酶标记一种抗体改为同块板上几种酶对应标记几种抗体(以PVX PVY PvS ) 第二,DAS..ELISA各种反应均在恒温摇床中进行,实现了快速同时检测多种马铃薯病毒Ellis等采用双抗体夹心法进行了PvY的鉴定和PvY血清型地理分布工作国内也广泛应用双抗体夹心法检测PvY并且己将此法应用于脱毒苗的检测中"宋吉轩等分别用改进DAs一ELISA法和常规DAS一ELISA法对马铃薯4种主要病毒PVX!PVY!PVS!PLRV进行检测,其检测结果完全一致,且灵敏度也基本相同=-04]"结果表明,改进DAs一ELIsA法是一种快速准确可靠的检测方法,适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测"

3 电子显微镜观察
取与PVX抗血清有阳性反应的马铃薯叶片,采用汁液负染法进行电镜观察。结果表明病毒粒体均为弯曲的线条状,大小5l5 X 13nm ,与PVX病毒相符。

4在紫外分光灯下刚定OD值 246nm(pvx)为最低,260nm为最高。消光系数OD260/280分别为1.22。

五 马铃薯花叶病病原的分子生物学方法
1根据NCBI报道的六种马铃薯病毒的保守序列设计马铃薯X病毒(PVX)!马铃
薯Y病毒(PVY)!马铃薯卷叶病毒(PLRV)!马铃薯M病毒(PVM)!马铃薯S病毒
(PVS)!马铃薯A病毒(PVA)的特异性引物对

2马铃薯病毒单重RT一pCR检测的灵敏度测定在马铃薯病毒单重灵敏度测定中,:将50一100mg马铃薯叶片或茎秆(薯块可以取幼芽提取RNA)放入研钵中,迅速加入液氮并将样品研磨至粉状,研磨充分后把粉末转移到离心管中,加入500ml裂解液(使用前应按比例加入p一琉基乙醇),溶液和粉末振荡均匀后将匀浆转移到CS过滤柱上,12000rpm下离心3min,吸取上清液到另外的离心管中,再加入上清液0.5倍体积的乙醇,混匀合均匀后将溶液和沉淀一起转移到CR吸附柱中,12000rPm离心lmin,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管"向吸附柱中加入7O0ul去蛋白液RWI,在12000rPm下离心lmin,倒掉废弃液,将吸附柱放回收集管,然后向吸附柱中加入5O0ul漂洗液RW,在1200OrPm下离心lmin,倒掉废弃液,重复洗涤一次"洗涤完后将吸附柱在12000rpm下离心2一3min,以去除残液,让吸附柱在室温下放置几分钟后,将吸附柱放入新的离心管中,向吸附柱的膜中央加入50一80ulddHZO,再在室温下放置几分钟,在1200Orpm下离心Zmin,得到提纯的总RNA"提取的RNA溶液,于一20e保存"制备1%的琼脂糖凝胶,电泳检测各病毒RNA的完整性,在120伏恒压条件下电泳30分钟以上,在凝胶成像仪上成像检测"先将六种病毒的RNA模板分别进行反转录,将得到的cDNA用核酸蛋白分析仪测定其含量,经测定,PVM的CDNA含量为710ng/ul,PVS的CDNA含量为63Ong/ul,PVX的CDNA含量为690ng/ul,PVY的eDNA28含量为680ng/ul,PVA的eDNA含量为605ng/ul,PLRV的eDNA含量为665ng/ul"再将各病毒的CnNA稀释为为:400ng/ul,300ng/ul,200ng/ul,100ng/ul,50ng/u1,25ng/u1六个梯度"检测结果为PVS,PVX,PVM病毒的检测灵敏度较高,达到50ng/u1,PVA ,PVY,PLRV病毒的检测灵敏度均为100ng/u1见图 "