巨噬细胞酸性磷酸酶的显示.docx

细胞生物学实验
巨噬细胞酸性磷酸酶的显示
一、 实验目的
以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、 实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、 实验仪器及试剂
a) 小白鼠：实验前2天，一部分腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞，另一部分不作处理。
b) 试剂：4％淀粉肉汤，10％中性福尔马林（pH6.8~7.1），酸性磷酸酶作用液 （现配），1％硫化铵溶液。
c) 水浴箱（ 50℃， 37℃ ）、低温冰箱、普通光学显微镜，小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、塑料滴管、载玻片染色盒（缸）、自制湿盒、塑料培养皿、盖玻片、载玻片。
四、 实验步骤
a) 巨噬细胞收集：分别用脱颈法处死一只腹腔注射4％淀粉肉汤1mL的小鼠和一只不注射的小鼠。然后都在腹腔注入2mL生理盐水，揉匀；剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用带针头的注射器插进腹腔吸取腹腔液。
b) 细胞黏附：对于注射了淀粉肉末的小鼠腹腔液一组共做6片，每片2~3滴，其中放入4℃冰箱黏附30min的每人一片；而放入湿盒内，50℃水浴30min，灭活酸性磷酸酶的则2人一片。对于未注射淀粉肉末的小鼠腹腔液则只做置于4℃下的4个片子即可。
c) 固定：将所有载玻片置于放有预冷的10％中性福尔马林的缸内在4℃冰箱中固定30min。
d) 自来水漂洗并浸于自来水中5min。
e) 加酸性磷酸酶作用液反应：再将水甩干，每个装片加入足量的酸性磷酸酶作用液，放在37℃的水浴锅中反应30min。
f) 用自来水漂洗片刻。
g) 加硫化铵反应：在通风橱中，加入1%硫化铵溶液后反应10min。
h) 在通风橱中自来水冲洗。
i) 带水加盖玻片显微观察。阳性标本细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。
五、 实验结果
a) 注射淀粉肉汤的在4℃下染色的图片

图中较大的细胞即为巨噬细胞。图中可看出巨噬细胞数量较多，而且巨噬细胞中都有棕色的颗粒，证明巨噬细胞中有磷酸酶的存在。
b) 注射淀粉肉汤的在50℃下染色的图片

图中较大个的为巨噬细胞，但是由于在50℃下，巨噬细胞内的酸性磷酸酶的活性已经被破坏，所以细胞并没有染上棕色，所以我们所看到的细胞基本处于无色状态。
c) 未注射淀粉肉汤的在4℃下染色的图片

图中细胞较大的为巨噬细胞，且因为细胞中的酸性磷酸酶未遭到破坏，所以被染上棕色。但是因为没有注射淀粉肉汤，所以图中的巨噬细胞相对于注射淀粉肉汤的巨噬细胞数量较少。
六、 实验分析
a) 由上述所有的实验结果可知道注射肉汤的巨噬细胞的数量更多，而且由细胞中棕色颗粒数量及颜色可以看出注射淀粉肉汤的巨噬细胞中的酸性磷酸酶的活性更高。
b) 50℃的时候，细胞中的磷酸酶的活性被破坏，所以无法被染上色。而在4℃磷酸酶只是暂时失活，在室温下进行染色时，磷酸酶的活性恢复，所以能被染上色。
c) 但是，图上细胞外也有很多的棕色颗粒，我不清楚是什么原因造成的。
七、 注意事项
a) 巨噬细胞一定要预先用淀粉肉汤激活，否则酸性磷酸酶活性差，染色浅。
b) 作用液应在临用时现配，储存一段时间后会产生絮状沉淀，影响反应效果。
c) 孵育时间过长也可发生酶扩散。
d) 避免酸性磷酸酶作用液在反应过程中干燥，否则其中的铅离子可与随后加入的硫化铵作用形成胞外沉淀影响结果观察。
八、 思考题
a) 比较淀粉肉汤注射组小鼠对照标本与正常处理标本的观察并解释。
淀粉肉汤注射组的巨噬细胞的数量更多，而且酸性磷酸酶的活性也更加高。因为注射淀粉肉汤可以诱导巨噬细胞趋化运动至腹腔。
b) 比较预先注射或不注射淀粉肉汤的小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活性。
注射淀粉肉汤的巨噬细胞中的磷酸酶的活性更高，分布更加广。
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