转基因抗虫棉花检测技术规范.docx

转基因抗虫棉花检测技术规范
——定 性 PCR 筛 查 方 法
（试 行）

编 制 说 明

为进一步加强对转基因抗虫棉花的安全监管，维护研发者、经营者和生产者的合法权益，保障人类健康和生态环境安全，根据《农业转基因生物安全管理条例》及其配套管理办法的规定和《关于加强转基因抗虫棉安全管理与监督检查的通知》(农办科 [2005] 15号)的要求，满足开展技术检测工作的需要，特制定本技术规范。
1、编制原则
本技术规范的编制遵循以下原则：
(1)法治性：本技术规范的编制，严格执行国家法律法规和强制性标准的规定，以保证国家和研发者、经营者、生产者的权益。
(2)可靠性：本技术规范的编制，力求反应相关领域研究成果的先进性、成熟性和代表性，以保证检测结果的精确性和重复性。
(3)实用性：本技术规范的编制，力求把经济实用和技术实用结合起来，以保证检测的操作简便和费用低廉。
(4)规范性：本技术规范的编制，力求做到技术内容叙述正确无误、文字表达简明易懂，以保证检测人员准确把握。
(5)操作性：本技术规范的编制，力求将操作过程中的要点进行细化和量化，以保证检测人员操作方便。
(6)兼容性：本技术规范的编制，参考和借鉴了国外同类标准或规范内容，以保证既符合国情又尽可能与国际接轨。
2、编制依据
本技术规范编制的法律依据主要有：
(1)《农业转基因生物安全管理条例》——中华人民共和国国务院令第304号；
(2)《农业转基因生物安全评价管理办法》——中华人民共和国农业部令第8号；
(3)《农业转基因生物进口安全管理办法》——中华人民共和国农业部令第9号；
(4)《农业转基因生物标识管理办法》——中华人民共和国农业部令第10号。
3、适用范围
转基因抗虫棉花可从以下三个方面进行检测：
(1)筛查检测：利用通用序列分别设计引物对棉花Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac和cry1Ab的融合基因进行PCR扩增，筛查确定样品是否含有转基因成分，以判断送（抽）检样品是否为转基因抗虫棉花。
(2)特异性检测：利用外源基因特异序列设计特异性引物对转基因抗虫棉花品种进行PCR扩增，检测确定样品所含外源基因类型，以判断送（抽）检样品是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
(3)品种（组合）鉴定：结合转基因抗虫棉花品种（组合）的特征、特性检测与鉴定，进一步检测或鉴定转基因抗虫棉花的品种（组合）名称，以判断该品种（组合）是否为国家批准种植或在国家批准区域内种植的转基因抗虫棉花。
具体检测技术路线流程如下图所示，可根据检测工作的实际需要，选择相应的检测技术路线。
送 （抽） 检 样 品

确定含
转基因成分否
确定含
目标基因类型
确定品种（组合）名称
通用引物检测
特异引物检测
特征特性检测

转基因抗虫棉花检测技术路线流程图

本技术规范规定了转基因棉花定性PCR筛查方法，适用于转基因棉花中转基因成分的定性PCR筛查。特异性检测和品种（组合）鉴定的技术规范，将根据实际情况适时予以发布。
4、检测方法
本技术规范包括棉花的Sad1基因和转基因抗虫棉花中的CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac与cry1Ab融合基因的定性PCR筛查方法。
5、检测条件
本技术规范实施的检测机构应具备以下条件：
(1)具备PCR检测所需的仪器设备和技术人员；
(2)具备相对独立的分子生物学检测实验室及其配套设施；
(3)客观、公正和中立，不从事转基因棉花的研发工作；
(4)承担检测的法律义务和责任，按规定对检测结果保密；
(5)严格执行农业部质量检验监督中心的管理规定和检测程序。
本技术规范受农业部农业转基因生物安全管理办公室委托，由农业部科技发展中心、中国农业科学院、南京农业大学、中国科学院、山东省农业科学院、吉林省农业科学院编制。
编制人员：魏启文、刘信、宋贵文、沈平、汪其怀、张永军、金芜军、崔洪志、周宝良、田颖川、吴家和、路兴波、张明等。

二oo五年三月
转基因抗虫棉花检测技术规范——定性PCR筛查方法（试行）

1 范围
本技术规范规定了转基因抗虫棉花定性PCR筛查方法。
本技术规范适用于转基因抗虫棉花中转基因成分的定性PCR筛查
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本技术规范的引用而成为本技术规范的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本技术规范，然而，鼓励根据本技术规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本技术规范。
NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求
NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。
3.1
Sad1基因
Sad1（stearoyl-acyl carrier protein desaturase；Genbank No. AJ132636）基因来源于陆地棉品种，该基因序列与其他植物（海岛棉、小麦、玉米、大麦、烟草、西红柿、油菜、水稻、向日葵等）类似基因的序列同源性很低。Sad1基因在陆地棉基因组内含有两个拷贝。 具体序列见附录A。
3.2
cry1Ac基因
人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ac基因。
cry1Ab基因
人工合成苏云金芽孢杆菌晶体蛋白1Ab基因。
cry1Ac与cry1Ab融合基因

3.3
转基因抗虫棉花
本技术规范中转基因抗虫棉花指含有cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因,具有对靶标昆虫具有毒杀功能的棉花。
4 原理
针对现有转基因抗虫棉花普遍含有的棉花Sad1内标准基因、CaMV 35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或者cry1Ab基因或者cry1Ac与cry1Ab融合基因，设计这些序列的特异性引物进行PCR扩增，以筛查棉花中是否含有转基因成分。
5 试剂、材料及溶液配制
除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。
5.1 10 mol/L NaOH溶液：
称取氢氧化钠80 g，先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL。
5.2 1 mol/L Tris-HCl
称取121.1g Tris碱溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，用水定容至1000 mL。在103.4kPa, 温度为121℃,灭菌20 min后贮备使用。
5.3 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液：
称取乙二铵四乙酸二钠18.6 g，加入70 mL水中，再加入10 mol/L NaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，用水定容到100 mL。在103.4kPa， 温度为121℃， 灭菌20 min。
5.4 抽提液（1000 ml）
药品 终浓度 称量样品
葡萄糖 0.35 M 69.3g
1M Tris-HCl（pH7.5） 0.1 M 100 ml
0.5M EDTA（pH8.0） 0.005 M 10 ml
聚乙烯吡咯烷酮(K30)（PVP） 2% (w/v) 20 g
DIECA（diethyldithiocarbamic acid） 0.1%(w/v) 1 g
β-巯基乙醇 0.2%（用时现加） 2 ml
重蒸馏水 定容至1000ml
5.5 裂解液
药品 终浓度 称量样品
氯化钠（NaCl） 1.4 M 81.7g
0.5M EDTA（pH8.0） 0.02 M 4ml
1M Tris-HCl（pH7.5） 0.1 M 100ml
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 2%（w/v） 20 g
PVP (K30) 2% (w/v) 20 g
DIECA 0.1% (w/v) 1 g
β-巯基乙醇 0.2% (用时现加) 2ml
重蒸馏水 定容至1000ml
5.6 25苯酚:24氯仿:1异戊醇（v/v）
5.7 24氯仿:1异戊醇（v/v）
5.8 10 mg/ml RNase A
将胰RNA酶（RNase A）溶于10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
5.9 异丙醇
5.10 3 M乙酸钠（pH 5.6）
将408.1g乙酸钠·H2O溶于800ml水中，用冰乙酸调pH至5.6，然后用水定容至1L，高压灭菌后备用。
5.11 70%乙醇
5.12 TE缓冲液（pH 8.0）：
1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL和500 mmol/L EDTA（pH8.0）溶液2 mL，用水定容至1000 mL。在103.4kPa, 温度为121℃， 灭菌20 min。
5.13 琼脂糖
5.14 溴化乙锭（EB）溶液：10 mg/mL。
注意： 溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应该戴一次性手套操作。
5.15 四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）各2.5 mmol/L的混合溶液。
5.16 50×TAE缓冲液：
称取 Tris 242.2 g，先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL( 500 mmol/L) EDTA的水溶液（pH 8.0），用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000 mL。
5.17 Taq DNA聚合酶（5单位/μL）及PCR反应缓冲液。
5.18 DNA分子量标准。
5.19 加样缓冲液：
称取溴酚蓝250 mg，加水10 mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲基苯腈蓝250 mg，用10 mL水溶解；称取蔗糖50 g，用30 mL水溶解，混合三种溶液，用水定容至100 mL，在4℃下保存。
5.20 引物。
5.20.1 Sad1基因。
s-F: CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA
s-R: TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC
预期扩增片段大小为108 bp。
5.20.2 nos终止子序列。
nos-F： 5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’；
nos-R： 5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’；
预期扩增片段大小为180 bp。
5.20.3 CaMV35S启动子序列。
35S-F：5'GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3'；
35S-R：5'GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3'；
预期扩增片段大小为195 bp。
5.20.4 cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因序列通用引物
cry1A-F：5’ GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC 3’；
cry1A-R：5’ CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’；
预期扩增片段大小为340 bp。
5.21 引物溶液。
用TE缓冲液（pH8.0）分别将上述引物稀释到10 µmol/L 。
5.22 PCR产物回收试剂盒。
按使用说明操作。
5.23 限制性内切酶XmnⅠ及反应缓冲液。
6 仪器
6.1 通常分子生物学实验室仪器设备。
6.2 PCR扩增仪。
6.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。
6.4 紫外透射仪。
6.5 凝胶成像系统。
6.6 重蒸馏水发生器。
7 操作步骤
7.1 抽样
参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样。
7.2 制样
参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样（按照GB 5491中四分法制备样品进行送检）。
7.3 DNA模板的制备
a 称取200-400 mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5 ml离心管中。
b 加入1ml预冷至4 ℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13 000 r/min离心机，4 ℃离心15 min，弃去上清液。
c 加入600 μl 预热到65 ℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65 ℃的水浴锅中裂解40 min。
d 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清液转至另一离心管中，加入5 μl RNase A （10 mg/ml），37 ℃ 水浴30 min。
e 分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。
f 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10 体积3M乙酸钠（pH 5.6），-20 ℃ 放置2-3 h，充分沉淀DNA。
g 13 000 r/min，4 ℃ 离心15 min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50 μl TE（pH8.0）溶解DNA。
h 把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20 ℃备用。
注意：
I 1 g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200 μg。
II DNA的OD260/OD280的比值应在1.8左右，且OD260的值应在曲线的最高峰。
7.4 PCR反应
7.4.1 试样的PCR反应
在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再加约50 μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。
在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（Sad1基因、nos终止子、CaMV35S启动子：94℃,30 s；56℃,30 s；72℃,30s；cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因：94℃,1 min；56℃, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。
表1 PCR反应体系
试剂
终浓度
单样品体积
ddH2O

31.25
10×PCR 缓冲液
1×
5 µl
25 mM MgCl2
2.5 mM
5 µl
10 mM dNTPs
0.2 mM
1 µl
10 µM Primer 1
0.5 µM
2.5 µl
10 µM Primer 2
0.5 µM
2.5 µl
5 U/µl Taq 酶
0.025 U/µl
0.25 µl
100 ng/µl DNA 模板
5 ng/µl
2.5 µl
总体积

50 µl

7.4.2 对照的PCR反应
在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。
阴性对照是指用非转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照是指用转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照是指用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分与7.4.1相同。
7.5 PCR产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为2%（w/v）的溶液，然后按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 µL溴化乙锭溶液的比例，加入溴化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物（需和上样缓冲液混合，10 µL-20µL），其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳，按2 V/cm 的电压电泳15-30 min。
7.6 凝胶成像分析（照相）
电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如果通过PCR结果能够明确判定试样是或不是转基因抗虫棉，则样品检测结束；如果不能明确判定，则进行以下试验，见7.7、7.8和7.9。
7.7 PCR产物的回收
将100 µl PCR反应液与上样缓冲液混合后，加入配制好的含2%（w/v）琼脂糖凝胶的泳道中，在其中的一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳。其余步骤按PCR产物回收试剂盒说明进行。
7.8 PCR产物的酶切鉴定
CaMV35S启动子扩增产物为195 bp，可以被限制性内切酶XmnⅠ切成大小为80 bp和115 bp的两个片段。取15 µL回收的PCR产物放入反应管中，加入1 µL的限制性内切酶XmnⅠ，再加入2 µL反应酶切反应缓冲液，加水2 µL配成20 µL反应体系，在37℃恒温水浴保温反应3小时。将20 µL反应液与上样缓冲液混合后加入配制好的2.5%（w/v）琼脂糖凝胶的一个泳道中，按7.5和7.6的步骤操作进行分析。
7.9 PCR产物的克隆和测序
对PCR产物片段按PCR产物回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收，连接到T-easy载体上，进行序列测定，并对测序结果进行比对和分析。

8 结果分析与表述
如果阳性对照的PCR反应中， Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因基因这四个序列都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出Sad1基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。
在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：
（1）在试样PCR反应中，只要Sad1内标准基因以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因抗虫基因都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明该样品为阳性结果，检出cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因。
（2）如果在试样和阴性对照的PCR反应中，仅有Sad1内标准基因片段得到扩增，表明该样品为阴性结果，未检出转基因成分。
（3）在试样PCR反应中， Sad1内标准基因得到了扩增，CaMV35S启动子、nos终止子或其中一种序列也得到了扩增， 且扩增片段大小与预期片段大小一致，但cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac与cry1Ab融合基因都没有得到扩增，表明该样品为阳性结果，检出转基因成分。此时，要求研发者提供相应的靶基因序列以便进行进一步验证。

附录A Sad1基因的序列
4081 CTTTCTTTCT TTCTTTTTTT TTTTTAACAT TAAAAATATG TAGAGAAAAT CAGCAATTAA
4141 AACAAAAGTT AGGGCTAATG TGTTAAAGTA GCACCAATAA AGTATCCCTC TCAAGTGAAG
4201 TCTTTCACAC TTGCAAACAA AAATAATTAA AAGACAGAGG AGTCTATAAA GTTAAAAGCC
4261 GTCCAAAACC CAAACCAGGA AAGGCAAACG AAAAGAAAAA ATGGCTTTGA ATTTTAATGC
4321 CATCGCCTCG AAATCTCAGA AGCTCCCTTG CTTTGCTCTT CCACCAAAGG CCACCCTTAG
4381 ATCTCCCAAG TTTTCCATGA TCTCCACCAT TCCTTCTGGC TCCAAGTTAG TGTCTTTCTT
4441 TCTTTTCTTT TTGGCTGGCG TTTTATTCAT TATTGTAATA ACTTGATCAT TCTCGCCTAT
4501 AATCATGGAT CATAACCTTT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTTT ACTTAAAGCT
4561 GATTTTGAAT CTGGGTTTTT GTTGTTTTGT CTAACTGACA TGGCTTTCAG GACTTCTCTT
4621 TTATGATATC TCACAATCTT AACGTTCTTG TTGTTTAATG GCCTCTAATC ATTGTTATGA
4681 TGAGATTTGA ACTTTTACAA ATTATGATAT TGTTGTCTTT GAATCCTTGG TAATAATGAT
4741 GATGTATGAG TATGAGAATG AAAGTAATCC CAAAGTTGGT TTATTTTTAC TGAACACAGA
4801 GAGGTTGGGA ATCTGAAAAA GCCTTTCACG CCTCCAAAGG AGGTGCCTGT TCAGATCACC
4861 CACTCCATGC CGCCTCACAA GATTGAGATC TTTAAATCTT TGGAGGGCTG GGCTGAGAAC
4921 AACATTCTGA CTCACCTCAA ACCAGTTGAG AAATGTTGGC AACCCGCCGA CTTTCTTCCA
4981 GATCCTAATT CTGATGGATT TCATGAGCAA GTCAAAGAGC TTAGGGAAAG GGCAAAGGAG
5041 ATCCCAGATG ATTACTTTGT AGTTTTGGTT GGTGATATGA TCACCGAGGA AGCCCTTTCA
5101 ACTTATCAAA CAATGCTTAA TACCTTGGAT GGAACTCGTG ATGAGACAGG TGCTAGCCTT
5161 ACCCCTTGGG CCATTTGGAC CAGGGCTTGG ACTGCTGAAG AAAACAGGCA TGGTGATCTG
5221 CTTAATAAGT ATCTCTACTT GTCTGGGAGA GTGGACATGA GGCAAATTGA GAGGACAATC
5281 CAGTACTTGA TTGGATCGGG AATGGTAAGA ATAACATACT TGCTACACAG TTTAGGAGGA
5341 TGATTGAGTG ATTGACATTT AATTACTCTT TTCAATTTCT AAGAAAGGAA AACAGACAAG
5401 CATGCAAGAT GTCATTATTT TCTTTTTATA CAGTTCCAAT CTGTCATTGT TAAACTAAAC
5461 TCTTTCTTCT GTATAACGAT AGGATCCTCA TACAGAGAAT AGTCCTTACC GAGGATTCAT
5521 ATATACTTCG TTCCAAGAAA GGGCAACTTT TATTTCCCAT GGGAATACAG GCAGGCTGGC
5581 TAAGGAGTAT GGGGATATTA ACTTGGCTCA AATTTGTGGT AGCATTGCCT CAGATGAGAA
5641 GCGCCACGAG ACAGCCTATA CCAAAATCGT TGAAAAGCTG TTTGAGATTG ATCCTGATGA
5701 AACAGTCCTG GCATTTGCTG ACATGATGAA GAAGAAAATC GCCATGCCGG CTGAGTTCAT
5761 CTATGATGGC AGAGATTATA ACTTATTTGA CCACTACTCA GCTGTTGCCC AAAGAATCGG
5821 GGTTTACACT GCTAAGGACT ATGTTGATAT AGTAGAGCAC CTGGTGGATC GATGGAAGGT
5881 GAAGGAGCTA GCTGGGCTTT CAGCCGAGGG GCGTAAAGCT CAGGACTACT TGTGTTCACT
5941 TCCTTCGAGA ATTAGAAGGT TAGAGGAGAG AGCGCAAGAA AAGGCCAAGG AAGCACCCAG
6001 TGTCCCATTC AGTTGGATAT TTGATAGAGA AGTGAAACTT TAGGTCATGA AATACAGTTA
6061 AGACTCCTGC AATGCATTTG AGGAAACAAA CACGAAGAAG CTGAATGCCA ACTTCTCTTT
6121 ATATATCCGA TGTAATAGAG GTTGTATATG TAACAGGAGG AATTGCGTGG CTTTGGTTAG
6181 GGTAGCACAT GTTTTCTGGA TGTGTTGTGT CCTTAAAAAA TAATGCCGAT AGCGGCAGCT
6241 GTGATAGTTT TAGATGTTTG TTTTCATAAT GTCTGTTATA TCGTTGTACG AGTAGTATGT
6301 GTTGTTTTTG TTGAAACAAT CTTCATATCT TAGTGATAAA TGATAATGCT GTGTAGTCAT
6361 AGTTTTTAGT TTGCAATAAA AAATTCCTTC TCGATATTGG GTTAGTTTTG TTTTGAATGG
6421 CAAAACCTAC TTTACATACC TTCAACATCT AGCGTTGTCA CTGTAGAAAA CGCAAGTGGT
6481 AAATTTCAAG CTGTAGATCG TACTTTTTCT TACACGAGTA ACACAGTTCA GCTAATTAGA
6541 G(下划线为Sad1基因的外显子（该基因编码区在4261-6043之间），引物见框中序列)