KJ 201909 食品中硼酸的快速检测 姜黄素比色法.doc

附件9

食品中硼酸的快速检测
姜黄素比色法
（KJ201909）

1　 范围
本方法规定了食品中硼酸的姜黄素比色快速检测方法。
本方法适用于粮食制品、淀粉及淀粉制品、糕点、豆制品、速冻食品（速冻面米食品、肉丸、蔬菜丸）中硼酸的快速测定。
2　 原理
本方法采用姜黄素比色法的原理，通过超声辅助用水提取样品中硼酸，用乙基己二醇-三氯甲烷溶液对样品中的硼酸进行快速的富集、萃取，利用硫酸与姜黄素混合生成的质子化姜黄与硼酸反应生成红色产物。溶液颜色的深浅与样品中硼酸的含量成正相关，通过色阶卡进行目视比色，确定样品中硼酸的含量。
3　 试剂与材料
除另有规定外，本方法所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
3.1　 试剂
3.1.1　 硫酸。
3.1.2　 无水乙醇。
3.1.3　 亚铁氰化钾。
3.1.4　 乙酸锌。
3.1.5　 姜黄素（CAS:458-37-7），纯度≥ 99%。
3.1.6　 冰乙酸。
3.1.7　 2-乙基-1,3-己二醇（色谱纯）。
3.1.8　 三氯甲烷（色谱纯）。
3.1.9　 硫酸溶液（1+1）：取等体积的硫酸（3.1.1）与水，将硫酸缓慢加入到水中，并用玻璃棒不断的搅拌，待冷却后装入塑料容器中。
3.1.10　 亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾（3.1.3），用水溶解并稀释至100 mL。
3.1.11　 乙酸锌溶液：称取22.0 g乙酸锌（3.1.4），用水溶解并稀释至100 mL。
3.1.12　 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液(EHD-CHCl3溶液)：称取2-乙基-1,3-己二醇(3.1.7) 10.6g，用三氯甲烷(3.1.8)溶解并稀释至100 mL，此溶液保存于塑料容器中。
3.1.13　 姜黄-冰乙酸溶液：称取姜黄素(3.1.5)40 mg，溶于100 mL冰乙酸(3.1.6)中，此溶液保存于塑料容器中，该溶液需临用新制。
3.2　 参考物质
硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1。
表1 硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量
中午名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相对分子质量
硼酸
Boric Acid
10043-35-3
H3BO3
61.8
3.3　 标准溶液配制
3.3.1　 硼酸标准储备液（1000 μg/mL）：准确称取在硫酸干燥器中干燥5 h以上的硼酸标准品适量，用水溶解并配制成1000 μg/mL的标准储备液，保存于塑料容器中。
3.3.2　 硼酸标准溶液（100 μg/mL）：取硼酸标准储备液10.0 mL，加水定容至100 mL，保存于塑料容器中。所配制溶液于0℃～4℃冰箱中可储存3个月。
3.4　 材料
硼酸快速检测试剂盒，需在阴凉、干燥、避光条件下保存。
4　 仪器与设备
4.1　 电子天平：感量为0.01 g。
4.2　 样品捣碎机。
4.3　 超声仪。
4.4　 离心机：转速≥4000 r/min。
4.5　 氮气吹干仪或空气吹干仪：温度控制≥60℃。
4.6　 涡旋振荡器。
4.7　 移液器：200 µL、1 mL、10 mL。
5　 分析步骤
5.1　 试样的制备
取适量样品，充分粉碎混匀。
5.2　 试样的提取
准确称取混合均匀的试样2 g（精确至0.1 g），置于50 mL离心管中，准确加水7 mL，加入硫酸溶液（3.1.9）2 mL，涡旋振荡提取1min后超声提取15 min，期间振摇2～3次，加入0.5mL亚铁氰化钾溶液（3.1.10）与0.5 mL乙酸锌溶液（3.1.11），混匀后于4000 r/min离心5 min(若离心效果不佳，可适当提高离心转速)，准确吸取1.0 mL上清液于2.0 mL离心管中，向离心管中加入EHD-CHCl3溶液（3.1.12）0.5 mL，上下颠倒振摇15～20次，静置分层（若有乳化现象，可低速离心），将上层溶液去除干净，取下层液体100 μL于2.0 mL离心管中，加入400 μL姜黄素-冰乙酸溶液（3.1.13），再加入20 μL硫酸溶液（3.1.9），于60℃～70℃水浴中氮气（或空气）吹至近干，加入1 mL无水乙醇，振摇使残渣全部溶解，为待测液。
注：粉丝、粉条等干基样品加入水和硫酸溶液后需浸泡15 min，再进行后续处理。
5.3　 测定步骤
将待测液与标准色阶卡目视比色，15 min内判读结果。需进行平行试验，两次测定结果应一致，即显色结果无肉眼可辨识差异。
注：整个试验避免在阳光直射的地方操作。
5.4　 质控试验
每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验（或加标质控试验）。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。
5.4.1　 空白试验
称取空白样品，按照5.1～5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2　 质控样品试验（或加标质控试验）
5.4.2.1　 质控样品
硼酸质控样品：采用典型样品基质或相似样品基质模拟实际生产工艺生产的，含有一定量硼酸(可考虑基质本底最大可能硼酸量)，并可稳定保存的样品。样品需经参比方法确认质控样品中硼酸的含量。
5.4.2.2　 加标质控样品
硼酸加标质控样品：准确称取空白试样2 g（精确至0.1 g），加入适量硼酸标准溶液（1000 µg/mL 或100 µg/mL）（3.3），使在不同基质样品中硼酸含量与5.4.2.1相同。
质控样品（或加标质控样品）按5.1和5.2步骤与样品同法操作。
6　 结果判定要求
观察待测液的颜色，与标准色阶卡比较判读样品中硼酸的含量。颜色浅于检测限（2.5 mg/kg）则为阴性样品；颜色深于检测限的根据颜色的深浅进行判读。色阶卡见图1。

图1 硼酸色阶卡
质控试验要求：空白试验测定结果应为阴性，质控样品试验测定结果应在其标示量值允差范围内，加标质控试验测定结果应与加标量相符。
7　 结论
由于色阶卡目视判读存在一定误差，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则。
8　 性能指标
8.1　 检测限
2.5mg/kg。
8.2　 灵敏度
灵敏度应≥99%。
8.3　 特异性
特异性应≥85%。
8.4　 假阴性率
假阴性率应≤1%。
8.5　 假阳性率
假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。
9　 其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。
若检测结果大于检测限，需对其进行研判，并采用参比方法确证。
本方法的参比方法为GB 5009.275-2016《食品安全国家标准 食品中硼酸的测定》。
附录A

快速检测方法性能指标计算表

表A.1 性能指标计算方法
样品情况a
检测结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1.=N11+N12
阴性
N21
N22
N2.=N21+N22
总数
N.1=N11+N12
N.2=N21+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(х2)
c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),
自由度（df）=1
灵敏度（p+，%）
p+=N11/N1.
特异性（p-，%）
p-=N22/N2.
假阴性率（pf-，%）
pf-=N12/N1.=100-灵敏度
假阳性率（pf+，%）
pf+=N21/N2.=100-特异性
相对准确度，%c
（N11+N22）/(N1.+N2.)
注：
a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时，结果≥2.5mg/kg时，判定为阳性（仅用于计算性能指标）；
c本方法规定：用于计算灵敏度和假阴性率的阳性样品，由参比方法检验得到的结果范围应在2.5～10mg/kg之间。
N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
d为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位：陕西省食品药品监督检验研究院
验证单位：江南大学、四川省食品药品检验检测院、湖北省食品质量安全监督检验研究院
本方法的主要起草人为：李涛 林芳 袁磊 乔蓉霞 孙秀兰 王一欣 周陶鸿