T∕CVMA 13-2018 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光 R∕T-PCR 检测方法.pdf
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1、ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 132018 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光 RT-PCR 检测方法 Duplex real-time RT-PCR assay for detection of avian influenza A (H7N9) virus 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 中国兽医协会CVMAT/CVMA 132018 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位:中国动物疫病预防控制中心 本标准主要起
2、草人:刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、张硕、韩焘、赵柏林。中国兽医协会CVMAT/CVMA 132018 1 H7N9 亚型禽流感病毒双重实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。 本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 541 兽
3、医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂 3.1 RNA 提取试剂 RNA提取试剂详见附录A.1A.4,或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。 3.2 5 RT-PCR 缓冲液 Tris base 15.14 g KCl 13.98 g MgCl2.6H2O 1.53 g DTT 3.86 g 加无核酸酶灭菌蒸馏水至 400 mL,调 pH 值至 8.3(室温下),定容至 500 mL。过滤(0.22 m)除菌后置于 28保存备用。 3.3. 10 PCR缓冲液的配制 Tris base 6.06 g KCl 18.64 g Triton X-100 5.00 mL 加无核酸酶灭菌蒸馏水至4
4、00 mL,用HCl调pH值至9.0(室温下),定容至500 mL。高压灭菌冷却后置于28保存备用。 3.3 引物和探针 中国兽医协会CVMAT/CVMA 132018 2 表1 所用引物和探针 3.4 其他试剂 Taq DNA聚合酶(5U/L)、AMV反转录酶(10U/L)、RNA酶抑制剂(40 U/L)、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。 4 仪器设备 分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20冰箱、可调移液器。 5 操作步骤 5.1 样品采集 样品采集按照NY/T 541进行。对于病死禽,取脑、肺、气管、喉头等组织;对于活禽,用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少
5、量泄殖腔粪便,放在含有保护液(50%甘油生理盐水)的同一离心管中,加盖,编号。 5.2 样品处理 5.2.1 组织样品 每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1 g,剪碎后取适量于研磨器中研磨,加入1.0 mL生理盐水继续研磨,待匀浆后转至灭菌离心管中,10,000 g 离心2 min,取上清液100 L于1.5 mL灭菌离心管中。 5.2.2 分泌物和排泄物样品 名称 序列(5-3 ) 目的基因 HA-7-F TGGTTTAGCTTCGGGGCRTCAT HA HA-7-R ACAAATAGTGCACYGCATGTTTCC HA-7-P FAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGB NA
6、-9-F ACACTCAAACGGAACAATACACG NA NA-9-R GACCACCCAATGCATTCCAC NA-9-P HEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB 注 1: 将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至 10 pmol/ L 后使用。 注 2:引物序列中,R 代表 A 或 G 碱基;Y 代表 C 或 T 碱基 中国兽医协会CVMAT/CVMA 132018 3 将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合,捻动、挤压干后弃去拭子。10,000 g离心5 min,吸取上清100 L于1.5 mL灭菌离心管中。 5.2.3 培养物样品 将培养物10,000 g离心5 m
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