核酸分离与纯化.pptx
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1、1v核酸核酸是分子生物学实验的主要研究对象,是分子生物学实验的主要研究对象,许多分子生物学实验的第一步都要进行许多分子生物学实验的第一步都要进行核酸的提取,如核酸的提取,如PCRPCR、基因测序及分子、基因测序及分子克隆等克隆等.v提取核酸的提取核酸的种类种类:真核细胞基因组真核细胞基因组DNADNA、质粒质粒DNADNA、总、总RNARNA及及mRNA mRNA 第1页/共32页2v 提取的核酸样品的完整性和纯度直接提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果关系到最后实验的结果v 鉴定技术鉴定技术 :分光光度技术分光光度技术:样品定量、纯度鉴定样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术凝胶
2、电泳技术:样品定量、纯度鉴定样品定量、纯度鉴定 分子量测定分子量测定 、分离核酸片段、分离核酸片段 第2页/共32页3第一节核酸分离与纯化的基本过程第一节核酸分离与纯化的基本过程一、材料与方法一、材料与方法 1.材料:血液、尿液、唾液、组织、培养细胞材料:血液、尿液、唾液、组织、培养细胞 2.方法:方法:保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性 原则原则 排除其他分子的污染,保证样品的纯度排除其他分子的污染,保证样品的纯度第3页/共32页4二、技术路线二、技术路线 1.核酸的释放核酸的释放 破碎细胞,释放核酸破碎细胞,释放核酸 方法:机械法方法:机械法 破坏线性破坏线性DNA 非机械法
3、非机械法 2.核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化 大分子污染物大分子污染物 污染物污染物 非需要的核酸分子非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂对后续实验有影响的溶液和试剂 第4页/共32页5 3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩浓缩:沉淀:有机溶剂沉淀法沉淀:有机溶剂沉淀法 原理:原理:洗涤:用洗涤:用7075乙醇去除沉淀中的盐乙醇去除沉淀中的盐第5页/共32页6 4 4、鉴定与保存、鉴定与保存 1.1.)核酸的鉴定)核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性浓度、纯度、完整性 浓度鉴定浓度鉴定 a a 紫外分光光度法紫外分光光度法 260nm260nm 在标准条件下,在标准条件
4、下,1 1个吸光度单位相当于个吸光度单位相当于 5050 g/mlg/ml的双链的双链DNADNA 38 38 g/mlg/ml的单链的单链DNADNA或或RNARNA 33 33 g/mlg/ml的单链寡聚核苷酸的单链寡聚核苷酸 b b 荧光光度法荧光光度法 荧光染料:荧光染料:溴化乙锭溴化乙锭 发出发出橙红色橙红色荧光荧光 第6页/共32页7 纯度鉴定纯度鉴定 a 紫外分光光度法:紫外分光光度法:测测A260A280的比值判断是否有蛋白质污染的比值判断是否有蛋白质污染 (为什么)(为什么)A260A280比值为比值为1.8,纯,纯DNA A260A280比值为比值为2.0,纯纯RNA b
5、荧光光度法:用溴化乙锭为染料示踪核荧光光度法:用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度酸电泳结果判断纯度第7页/共32页8 完整性鉴定:用溴化乙锭为染料示踪核酸完整性鉴定:用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断完整性。电泳结果判断完整性。2)核酸的保存)核酸的保存 DNA的保存的保存 pH 影响影响DNA稳定性稳定性 pH7.08.0 EDTA 减少二价金属离子减少二价金属离子 氯仿氯仿 防止细菌污染防止细菌污染 温度温度 低温低温-70 保存数年保存数年 4 保存保存第8页/共32页9 RNA的保存的保存 a 0.3molL的醋酸钠或双蒸水,的醋酸钠或双蒸水,-70-80。若加入。若加入RN
6、A酶抑制剂可延长保存时间。酶抑制剂可延长保存时间。b 将将RNA沉淀溶于沉淀溶于70乙醇溶液或去离子的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中,甲酰胺溶液中,-20 可长期保存。可长期保存。小量分装保存小量分装保存第9页/共32页10第二节第二节 基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化一、分离与纯化的方法一、分离与纯化的方法 1.酚抽提法酚抽提法:EDTA裂解缓冲液裂解缓冲液 SDS 裂解细胞裂解细胞 蛋白酶蛋白酶K RNA酶酶 pH8.0的的Tris饱和酚抽提饱和酚抽提 醋酸铵、无醋酸铵、无水乙醇沉淀水乙醇沉淀 70乙醇洗涤乙醇洗涤 DNA 第10页/共32页11第11页/共32页122.DNA样
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