PCR原理及其操作.ppt
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1、PCR反应原理及其操作生物化工生物化工韩韩 栋栋 1.PCR的基本原理的基本原理 2.PCR反应体系反应体系 3.PCR的基本步骤的基本步骤 4.PCR反应五要素反应五要素 5.PCR 的反应流程的反应流程PCR的基本原理的基本原理vv试管中管中进行的行的DNA复制反复制反应,依据,依据DNA半保留复制半保留复制的机理;的机理;体体外外DNA分分子子于于不不同同温温度度下下可可变性性和复性和复性的性的性质;vv通通过人人为控控制制体体外外合合成成系系统的的温温度度,使使双双链DNA变成成单链,单链DNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火,DNA聚聚合合酶使使引引物物沿沿着着单链模模板板延
2、延伸伸为双双链DNA。PCR反反应体系体系v4种dNTP混合物 各200umol/Lv引物 各10100pmolv模板DNA 0.12ugvTaq DNA聚合酶 2.5uvMg2+1.5mmol/LPCR的基本步的基本步骤 7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR的基本步的基本步骤v1.变性:高温使双链变性:高温使双链DNA解离形成单解离形成单链(链(94,30s)。)。v2.退火:低温下,引物与模板退火:低温下,引物与模板DNA互互补区结合(补区结合(55,30s)。)。v3.延伸:中温延伸。延伸:中温延伸。DNA聚合酶催化聚合酶催化以引物为起始点的以引物为起始点的
3、DNA链延伸反应链延伸反应(7072,3060s)PCR的基本步的基本步骤1234522557294时间(min)温度()低温退火2高温变性1适温延伸3重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍高温高温变性性低温退火低温退火中温延伸中温延伸uuPCR每每一一步步的的转换通通过温温度度的的改改变控控制制。DNA模模板板解解链(变性性)、引引物物与与模模板板结合合(退退火火)、DNA聚聚合合酶催催化化新新生生DNA的的合合成成(延延伸伸)三三个步个步骤构成构成PCR反反应的一个循的一个循环。uu此此循循环反反复复进行
4、行,可可使使目目的的DNA得得以迅速以迅速扩增。增。uu理理论扩增增率率:2n递增增(n为循循环次次数数),2530循循环,目目标DNA可可增增加加109倍。倍。uu实际扩增增率率:()n,X为PCR的的实际扩增率,增率,平均平均约为75%。uu由由于于引引物物和和底底物物的的消消耗耗,酶活活力力的的下下降降等等因因素素,扩增增产物物的的增增加加,逐逐渐由由指指数数形形式式变为线性性形形式式,所所以以实际上上进行行30个个循循环后后,扩增增倍倍数数一一般般可可达达106107。uu以以上上“变性性、退退火火、延延伸伸”三三部部曲曲为PCR一一轮循循环。PCR扩增曲增曲线PCR反应五要素反应五要
5、素v1.引物引物(primer)v2.酶酶(Taq DNA polymerase)v3.dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)v4.模板模板(template)v5.Mg2+(magnesium)1.引物引物引物是引物是PCR特异性反应的关键,特异性反应的关键,PCR 产物的特产物的特异性取决于引物与模板异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。引物设计的原则引
6、物设计的原则引物长度:引物长度:15-30bp,常用为,常用为20bp左右;左右;引物扩增跨度:引物扩增跨度:以以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至为宜,特定条件下可扩增长至10kb;引物碱基:引物碱基:G+C含量以含量以40-60%为宜,为宜,G+C太少扩增效果不佳,太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免最好随机分布,避免5个以上个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;避免引物内部出现二级结构:避免引物内部出现二级结构:避免两条引物间互补,特别是避免两条引物间互补,特别是3端的端的互补,否则会形成引
7、物二聚体,产生非特异的扩增条带;互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;引物引物3端的碱基应严格要求配对:端的碱基应严格要求配对:特别是最末及倒数第二个碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;失败;引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;引物的特异性:引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物量引物
8、量引物量引物量:每每每每条引物的浓度条引物的浓度条引物的浓度条引物的浓度0.1 0.50.1 0.5 MM,以最低引物量产生所需要的,以最低引物量产生所需要的,以最低引物量产生所需要的,以最低引物量产生所需要的结果为好结果为好结果为好结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会形成二聚体的机会2.酶及其浓度酶及其浓度目前有两种目前有两种Taq DNA 聚合酶供应:聚合酶
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