分子病理学技术在临床中应用.ppt
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1、分子病理学在分子病理学在临床医学中的床医学中的应用用分子病理学的诞生 近十几年来,医学获得了分子生物学理论和实验的充实,建立起许多完全崭新的临床检验方法,甚至部分替换某些旧的传统检测方法。从广度上从广度上-扩大了临床观察视野 从深度上从深度上-达到基因分析境界 分子病理学在此基础上诞生并发展起来。分子病理学作为病理学的一个现代分支,为国内外所公认。分子病理学的发展 分子病理学的发展由始即以拥有大量实验、技术逐日进步为特征,并彼此相辅相成。分子生物学家不熟悉疾病,临床学家忙于临床防治疾病,使分子生物学当代理论和实验及时的引进、提炼并为临床诊断、认识疾病服务,这一历史任务,落在病理学工作者的肩上。
2、病理诊断技术经典的HE切片观察辅助技术1、特殊染色技术2、免疫组织化学技术3、分子生物学技术病理学病理学历史:器官史:器官细胞胞分子(分子病理)分子(分子病理)超微超微结构病理学构病理学(Ultrastructural pathology):E/M观察察器官(解剖)病理学器官(解剖)病理学(Organ pathology,1761):肉眼:肉眼观察察细胞(胞(组织)病理学)病理学(Cellular pathology,1854):L/M观察察免疫病理学免疫病理学(Immunopathology):免疫:免疫组化化分子病理学分子病理学(Molecular pathology)遗传遗传病理学病理学
3、(Genetic pathology)定量病理学定量病理学(Quantitative pathology)一项覆盖了9个国家和地区,1217例病人的泛亚洲科研显示:没有相关的靶标却接受了靶向治疗,死亡风险将增加185%。新英格兰医学杂志.2009.9.v361(10).“我知道每个患者不一样,而且需要个体化治疗,但我更需要知道他们有何不一样,如何根据这些不一样来实施个体化治疗。”一位中国临床肿瘤医生,2009分子靶向治疗的概念分子靶向治疗是指“针对参与肿瘤发生发展过程中的细胞信号转导和其他生物学途径的各种阻抑手段”,其治疗靶点可以是细胞表面的生长因子受体或者细胞内信号转导通路中的重要酶或蛋白。
4、广义的分子靶点则包括参与肿瘤细胞分化、分裂、凋亡、迁移、浸润、淋巴结及全身转移过程,从DNA 到蛋白水平的任何亚细胞分子。靶向治疗与个性化治疗医学分子生物学领域的革命不断影响着肿瘤的诊断和治疗。在规范化治疗的基础上逐步发展为个性(体)化治疗。个性(体)化治疗的核心是靶向治疗。分子病理诊断是靶向治疗的基础。基因诊断的定义 基因诊断是通过直接探查基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基因诊断的探测目的物是DNA或RNA。DNA-反映了基因的存在状态 RNA-反映了基因的表达状态探查基因的分类内源基因-机体自身的基因 用于诊断基因有无病变外源基因-如病毒,细菌等 用于诊断有无病原体感染分子病理学
5、诊断分子病理学理论与技术的应用,拓宽了病理诊断的视角,发展了新的研究领域。分子病理学诊断在指导肿瘤治疗中拥有特殊优势,即在组织学的基础上对肿瘤基因状态进行精细的分类和检测:1 增加诊断的准确性、改善预后的评估,并指导临床处理。2 区别不同基因类型的病人,设计合理的临床治疗方案。3 增加药物的特异性和安全性,最大限度地优化治疗。4 识别癌症易受攻击部位的信号途径,选择药物的靶点。5 检测治疗中基因表达的变化,随时调整治疗方案。相对于其他疾病,肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展,人们对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体
6、化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。但是,如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。大量的临床研究和试验结果表明:特异肿瘤分子标志物(靶标)是识别患者个体差异的重要依据,实现对这些靶标的检测是实施肿瘤个体化治疗的前提和基础。用于识别肿瘤患者个体差异的靶标大致可归纳为三类:1)肿瘤治疗性药物的作用靶标:如HER2基因拷贝数和EGFR基因突变;2)肿瘤药物代谢相关的靶标:如UGT1A1和CYP2D6等基因多态性;3)肿瘤药物作用路径的相关靶标:如KRAS基因突变和ERCC1基因mRNA表 达水平。随着抗肿瘤药物的不断增加以
7、及研究的深入,与作用路径有关的靶标越来越多。检测也从以前的单一靶标发展为多靶标联合进行。通过针对不同癌种的系统靶标检测,筛选适合患者个体的药物,提高治疗的针对性和有效率。分子病理学用于基因诊断的常用手段 原位杂交:CISH(显色原为杂交);FISH(包括单色和多色);SISH(双标,银染色)。DNA序列分析:DNA-SEQUENCING;PCR-RFLP;PCR-SSCP;D-HPLC;其他:包括基因芯片、实时定量PCR、Southern、Western等 常用的靶向药物美罗华(利妥昔,Rituximab)赫赛丁(曲妥珠单抗,Trastuzumab)帕妥珠单抗(Pertuzumab,Omnit
8、arg)格列卫(伊马替尼,Imatinib)西妥昔(Cetuxamab)特罗凯(厄洛替尼,Erlotinib)易瑞沙(吉非替尼,gefitinib)贝伐单抗(Bevacizumab)靶向治疗应用较为广泛的肿瘤淋巴瘤(CD20阳性)乳腺癌(HER2阳性)胃肠间质瘤(CD117/CD34阳性)肺癌胃肠癌隆突性皮肤纤维肉瘤结直肠癌爱必妥是抗EGFR(表皮生长因子受体)单克隆抗体(单抗),用于治疗结直肠癌的生物靶向治疗药物。结直肠癌(CRC)属危害严重的消化道恶性肿瘤,其发病率约占所有恶性肿瘤的1015%,是西方国家导致癌症相关死亡的第二大疾病。目前,中国CRC发病也逐年上升速,每年新增病例高达40万
9、人。结直肠癌的治疗与其它实体肿瘤一样,治疗方法包括手术治疗、化疗、放疗。以化疗为例,化疗药物从最初单一的药物,到联合的细胞毒药物,再到靶向药物,经历了一代代革新,对疾病的治疗效果也出现突破性的进展。什么是KRAS基因?KRAS基因跟治疗有什么关系?北京肿瘤医院消化内科主任琳教授解释:“它是一个信号传导重要的路径,肿瘤信号必然要通过这个途径进行传导,传导完成后,肿瘤细胞才能增值、分化、生存,如果传导被阻断,肿瘤细胞就没有繁殖能力,就要死掉。”军事医学科学院307医院消化肿瘤内科主任徐建明教授:“K-RAS基因检测则是了解结直肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。只有KRAS基因未发生突变的患者
10、才适合使用EGFR靶向药物治疗。因此,K-RAS基因检测可以筛选出EGFR受体靶向药物治疗有效的CRC癌患者,实现患者的个体化治疗,从而获得良好的预后,延长患者的生命。更为重要的是,检测能够帮助早期症状不明显的结直肠癌患者尽早得知病情,实现癌症的早发现、早治疗,避免错过最佳治疗时机。”易瑞沙治疗肺癌的机理靶向药物吉非替尼能够与EGFR细胞内的ATP结合位点上的三磷酸腺苷竞争,阻断其酪氨酸激酶活性,进而阻断EGFR的信号传导通路,阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成,并可诱导肿瘤细胞的凋亡 血管内皮细胞生长因子VEGF作用机理内皮抑制素 1 核仁素(nucleolin)2 整合素(integrin)E
11、ndostatin 抑制VEGR诱导的NO合成和内皮细胞迁移,促进凋亡;与pro-MMP2结合,抑制MMP2等。VEGF-R 通过Ras-Raf-MEK-ERK/MAPK及PI3K-AKT通路VEGF抑制剂血管内皮生长因子(VEGF)与VEGF受体,VEGFR-1(FIt-1)和VEGFR-2结合。VEGFR-2的激活是VEGF诱导有丝分裂、血管生成和血管渗透性所必须的。VEGFRs是跨膜受体,在胞浆结构域内具有保守的PTK活性,与配基结合引起VEGFR双聚体,依次激活激酶的活性和细胞内特异性VEGFR酪氨酸残基的自动磷酸化。酪氨酸残基的自动磷酸化进一步增加TK的催化活性,并为胞浆信号传递分子
12、提供结合位点。这些细胞内信号蛋白的相互作用,诱导细胞对VEGF反应。临床医师的机遇与挑战传统的病例诊断没有过时,但要与时俱进!目前,是从规范化治疗到个性化治疗的过渡时期。当前我们面临严峻的挑战和难逢机遇,临床医师不会错过、发展的大好机会!29FISHFISH技术在临床中的应用技术在临床中的应用30FISH检测在临床中的应用血液病检测产前诊断实体瘤组织检测FISH在实体肿瘤应用的目的 个体化治疗方案确定 肿瘤诊断 预后判断32 肿瘤的形成细胞内肿瘤相关基因发生异常(癌细胞)细胞内肿瘤相关基因发生异常(癌细胞)细胞功能发生改变细胞功能发生改变 细胞形态发生改变细胞形态发生改变 癌细胞不断异常增殖癌
13、细胞不断异常增殖 肿瘤形成肿瘤形成肿瘤发生过程34从分子水平对疾病的重新认识不断提高的诊断技术和不断积累的临床实践将来的肿瘤治疗模式:以分子病理学诊断为基础的综合性靶向治疗分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化分子病理学引起肿瘤治疗模式的变化肿瘤部位(瘤部位(实体)体)肿瘤瘤组织分子病理分子病理学学肿瘤的基因瘤的基因类型型在乳腺癌检测中的应用在乳腺癌检测中的应用我国女性的乳腺癌发病率为20.1/10万GLOBOCAN 2002,IARC。乳腺癌的流行病学调查欧美为高发地区,发病率在6080/10万左右,位列女性恶性肿瘤发生的第一位,且逐年上升。而乳癌的死亡率大约占女性恶性肿瘤死亡的15左右,仅次于肺
14、癌(25)。我国的乳癌发病率在20/10万左右,在女性恶性肿瘤中位列第三位,而且发病率也成逐年上升的趋势。在一些大城市如上海,1999年的调查显示,乳癌的发病率已经达到52.9/10万。乳腺癌治疗新进展新的治疗理念 剂量密度和剂量强度新的治疗药物 蒽环类药物新的应用 以紫杉醇为代表的传统药物 以赫塞汀为代表的靶向药物1=基因拷基因拷贝2=mRNA 转录3=细胞表面受体胞表面受体4=受体受体细胞外片断胞外片断正常正常细胞胞肿瘤瘤细胞胞CytoplasmHER2 受体受体CytoplasmicmembraneNucleusHER2 DNAHER2mRNA1234 乳腺癌靶向治疗乳腺癌靶向治疗HER
15、-2基因扩增检测1987著名杂志科学发表HER2对乳腺癌的意义HER2HER2!HER2HER2是有别于肿瘤大小、淋巴结及激素受体外的乳腺癌是有别于肿瘤大小、淋巴结及激素受体外的乳腺癌重要重要预后因子预后因子!HER2HER2是肿瘤复发和生存期长短的是肿瘤复发和生存期长短的独立独立预后因子预后因子1998 年美国FDA 批准第一个专门针对p185高表达乳腺癌的抗体治疗药物Herceptin上市,在全世界开创了单抗类分子靶向药物治疗肿瘤的新时代。HER-2过表达与生物靶向治疗 下调细胞表面的HER一2蛋白 减少血管内皮生长因子的产生 介导对过度表达HER一2的肿瘤细胞的抗体依 赖性细胞毒作用(A
16、DCC)抑制HER一2蛋白与受体酪氨酸激酶超家族的 其他成员发生交联形成异质二聚体 减弱细胞生长信号的传递 通过诱导P27kipi和RB相关蛋白P130而大量减 少s期细胞数目 增强化疗所致细胞毒性赫赫赛汀汀(Herceptin)抗抗肿瘤机制瘤机制赫赛汀赫赛汀靶向靶向HER2的人源化单抗的人源化单抗用于治疗用于治疗用于治疗用于治疗HER2HER2阳性乳腺癌阳性乳腺癌阳性乳腺癌阳性乳腺癌生存率提高达生存率提高达生存率提高达生存率提高达45%45%疗效改善并持续疗效改善并持续疗效改善并持续疗效改善并持续生活质量得以改善生活质量得以改善生活质量得以改善生活质量得以改善95%95%95%95%人源化人
17、源化人源化人源化,5%,5%,5%,5%鼠抗,具有高度亲和性鼠抗,具有高度亲和性鼠抗,具有高度亲和性鼠抗,具有高度亲和性 (K(K(K(Kd d d d=0.1nM)=0.1nM)=0.1nM)=0.1nM)和和和和特异性,显著降低免疫原性特异性,显著降低免疫原性特异性,显著降低免疫原性特异性,显著降低免疫原性(HAMA)HAMA)HAMA)HAMA)HER2HER2HER2HER2状状状状态态是是是是选择选择赫赫赫赫赛赛汀汀汀汀 的重要指的重要指的重要指的重要指标标Her-2Her-2的概况的概况uHer-2:又名C-erbB-2,Her-2/neuu属于EGFR家族成员u为原癌基因,编码跨
18、膜型酪氨酸激酶生长因子受体u2530%的乳腺癌为 Her-2基因的扩增/过度表达u Her2基因扩增的乳腺癌被认为对内分泌治疗相对不敏感1.001.000.750.750.500.500.250.25 0 0累计生存率累计生存率0 24 48 72 96 120 1440 24 48 72 96 120 144无扩增无扩增扩增扩增基因扩增基因扩增:10:10 拷贝数拷贝数无基因扩增无基因扩增:3:3拷贝数拷贝数临界值临界值:不包括不包括死亡时间死亡时间 (月数月数)Log rank p0.001Log rank p0.001Ross JS,Fletcher JA.Stem Cells 1998
19、;16:413428 HER-2HER-2HER-2HER-2扩扩增患者无病生存期增患者无病生存期增患者无病生存期增患者无病生存期缩缩短短短短淋巴结阴性淋巴结阴性淋巴结阴性淋巴结阴性Seshadri R et al.J Clin Oncol 1993;11:1936421008060402000 12 24 36 48 60 72无病生存概率无病生存概率死亡时间死亡时间 (月数月数)HER2 HER2 基因基因 3 40HPV年年龄30岁平均平均824个月个月CIN I(组织学)学)CIN II/III(组织学)学)无无细胞学改胞学改变/HPV消除消除子子宫颈浸浸润癌癌机体免疫机制机体免疫机制
20、辅助致癌因素助致癌因素 HPVHPV感染与宫颈病变的自然过程感染与宫颈病变的自然过程潜伏感染期潜伏感染期 亚临床感染期床感染期 临床症状期床症状期 HPV相关相关肿瘤期瘤期810年年细胞非典型性发育异常细胞非典型性发育异常细胞癌变细胞癌变阻止细胞正常凋亡阻止细胞正常凋亡高危型高危型HPVHPV持续性感染持续性感染人类染色体人类染色体端粒酶基因端粒酶基因(hTERC)(hTERC)扩增扩增致癌基因致癌基因E6/E7E6/E7编码的原癌蛋白表达编码的原癌蛋白表达TERCTERC基因的扩增可阻止细胞凋亡,导致肿瘤产生基因的扩增可阻止细胞凋亡,导致肿瘤产生 hTERChTERC基因与宫颈癌基因与宫颈癌
21、 hTERChTERC基因是人染色体端粒酶的编码基因基因是人染色体端粒酶的编码基因 端粒酶端粒酶在大多数正常体细胞中无活性,随着细胞分裂次数在大多数正常体细胞中无活性,随着细胞分裂次数 的增加,端粒缩短,细胞死亡。的增加,端粒缩短,细胞死亡。在宫颈癌中,在宫颈癌中,端粒酶活性增加端粒酶活性增加,维持端粒长度,细胞永生,维持端粒长度,细胞永生 化,免于凋亡,发生癌变。化,免于凋亡,发生癌变。子宫颈细胞子宫颈细胞hTERChTERC位点扩增检测试剂盒位点扩增检测试剂盒CSP3hTERC hTERChTERC基因定位于基因定位于3q26.33q26.3 3 3号染色体着丝粒信号号染色体着丝粒信号子子
22、宫颈细胞胞hTERChTERC位点位点扩增增检测试剂盒盒三、临床检测三、临床检测TERC基因的意义基因的意义FISH在宫颈癌诊断中的应用宫颈癌发生及发展阶段 正常ASCUSCIN1CIN2CIN3(原位癌)浸润癌人类染色体端粒酶(hTERC)基因,GLP TERC:3q26.3有效进行子宫颈癌前病变的病理分级 TBSTBS分级分级正常正常/炎症炎症ASCUSASCUSASC-HASC-HLSILLSILHSILHSILTERCTERC基因扩增发生率(基因扩增发生率(%)4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分级病理分级正常正常/炎症炎症CIN 1CIN
23、 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3原位癌原位癌TERCTERC基因扩增发生率(基因扩增发生率(%)4.24.27.37.369.269.285.185.195.795.7 以以hTERChTERC基因扩增阳性诊断基因扩增阳性诊断CIN2CIN2或或CIN2CIN2以上病变的以上病变的 敏感度为敏感度为82.17%,82.17%,特异度为特异度为95.02%95.02%辅助病理分级辅助病理分级Am J Pathol 2003,163:14051416 参考文献 以以hTERChTERC基因扩增阳性诊断基因扩增阳性诊断HSLIHSLI以上病以上病 变的敏感性为变的敏感性为 92%92%,
24、特异性为,特异性为91%91%。辅助辅助TBSTBS分级分级卫生部多中心临床试验卫生部多中心临床试验 FISHFISH检测子宫颈上皮细胞检测子宫颈上皮细胞hTERChTERC基因扩增的临床应用研究基因扩增的临床应用研究:u 本课题全国共本课题全国共8686个单位参加。个单位参加。u 共检测共检测84438443例宫颈细胞学样本。例宫颈细胞学样本。u 其中其中72717271例有病理结果。例有病理结果。宫颈癌FISH检测临床意义伴有hTERC基因扩增的癌前病变的病人有52%96%的恶变可能。可预测CIN1/CIN2 向CIN3发展的风险因素,其灵敏度是100%,特异性是 70%.FISH是进行筛
25、查,早期诊断和风险预测的有效手段(AJP April 2005,Vol.166,No.4)u明确病理分级:明确病理分级:将ASC-US/CIN 1(低度癌前发育异常)和CIN 2/CIN 3(高度癌前病变)进行区分,指导临床治疗方案选择u风险预测,评估癌变可能性:风险预测,评估癌变可能性:对于CIN 1/CIN 2患者,TERC基因扩增阳性的子宫颈病变患者发生进展/恶变的可能性超过50%u监测癌变的发生和发展:监测癌变的发生和发展:对于Ascus以上级病变的随访及经leep治疗后复发的监测TERC基因检测的临床意义四、宫颈癌的常用临床方法四、宫颈癌的常用临床方法应用介绍应用介绍 临床提示,从H
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