DB13_T1767-2013苹果品种DNA指纹鉴定.docx
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1、ICS 65.020.20B 05DB13河北省地方标准DB 13/T 17672013苹果品种 DNA 指纹鉴定2013 - 09 - 05 发布2013 - 09 - 30 实施河北省质量技术监督局发 布DB13/T 17672013前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省林业厅提出。本标准起草单位:河北农业大学。本标准主要起草人:刘兴菊、杨敏生、梁海永、张军、左立辉、李雪雁、姚伟明、杨立华、韩志校魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。IDB13/T 17672013苹果品种 DNA 指纹鉴定1 范围本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。本标准适用于苹果品种鉴定
2、及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。2 原理不同苹果品种由于遗传组成不同,基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异,这种差异可经过PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分,从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、叶片等组织中提取总DNA,利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增,不同碱基长度的PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(或通过DNA分析仪、测序仪进行分离),并通过染色显示DNA 指纹谱带类型。3 仪器设备及试剂苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。4 溶液配制苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。5 鉴定方法5.1 样品
3、准备5.1.1 取样量每份送检样品至少检测3个个体,每个个体至少1g,对一致性差的样品应至少检测5个个体。5.1.2 品种比较方式a) 成对品种的比较送检样品提供两份,一份为待检品种,一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比较。杂交后代需提供母本与父本的样品。b) 品种与 DNA 指纹库入库品种的比较送检样品可提供一份。将待检样品与 DNA 指纹库所有入库品种的指纹进行比较,筛选出指纹最相似或相同的品种作为待检品种的近似品种,然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。5.2 DNA 提 取15.2.1 宜采用改良的 CTAB 法。取 200mg 干净叶片置入 1.5mL 离心管中,加
4、入 500LDNA 提取液研磨碎, 并加 1mL 洗涤液及 30L-巯基乙醇,充分摇匀后置冰上 5min,于 4,12000 g 离心 8min 后,洗涤一次,弃上清,再加 700L 预热的 CTAB 缓冲液,充分混匀后,于 65水浴 60min,其间颠倒几次。然后于室温冷却4 min5min,取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25241),混匀抽提,室温静置5min,于室温 12000 g 离心 8min。上清液移于一新的 1.5mL 离心管中,加入等体积氯仿异戊醇(241),充分混匀后室温静置 5min,室温 12000g 离心 8min,取上清,重复加等体积氯仿异戊醇(241)抽提,
5、取上清加入等体积氯仿抽提一次,取上清液,加入 2 倍体积的无水乙醇(-20),轻轻混匀后在-20沉淀 30 分钟以上,12000 g 离心 10min,将所得沉淀风干后溶于 100L 水中,置 4冰箱备用。5.2.2 其它保证 DNA 质量的方法也可采用,应用前需要通过微量紫外分光光度计进行 DNA 质量与浓度检测。5.3 PCR 扩增5.3.1 SSR 扩增基本核心引物名单见附录C。5.3.2 反应体系反应液体积为20L,组分配制应符合表1的规定(或按比例减少至10L)。表1 PCR 反应体系反应组分原浓度终浓度反应体积 LddH2O13.3510buffer1012MgCl225mmol/
6、L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/L0.15mmol/L1.2Taq 酶5U/L1U0.2引物20mol/L0.25mol/L0.25DNA3050ng/L1.52.5 ng/L15.3.3 反应程序94预变性5min;94变性50s,55退火50s,72延伸50s,共30个循环;72延伸7min,4保存。5.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5.4.1 清洗玻璃板用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净,双蒸水擦洗两遍,95%乙醇擦洗两遍,干燥。在长板上涂上0.5 mL亲和硅烷工作液,带凹槽的短板上涂0.5 mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。5.4.2 组装电泳板待玻璃板
7、彻底干燥后组装电泳板,并用水平仪调平。2显影液中轻轻晃动至带纹出现定影 固定液中定影 5 min双蒸水漂洗 1 min5.4.3 灌胶在100 mL 4 .5%PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100L,迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部, 在上部轻轻插入梳子,使其聚合至少lh以上。灌胶过程中防止出现气泡。5.4.4 预电泳在正极槽中加入1TBE缓冲液600 mL,在负极槽(上槽)加入预热至65的ITBE缓冲液600 mL,拔出梳子。90W恒功率预电泳10 min20 min。5.4.5 变性在20L PCR样品中加入4L6加样缓冲液,混匀后,在PCR仪上运行变性程序: 95变性5min
8、,4 冷却10 min以上。5.4.6 电泳用移液器吹吸加样槽,清除气泡和杂质,插入样品梳子。每一个加样孔点入5L样品。80W恒功率电 泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部(约40 min)。电泳结束后,小心分开两块玻璃板,凝胶会紧贴在长板上。5.5 银染银染 染色液中染色约 1015 min5.5.1 银染流程图固定液中轻轻晃动 3 min双蒸水快速漂洗 1 次,不超过 10 s双蒸水快速漂洗 1 次,不超过 10 s双蒸水快速漂洗 1 次,不超过 30 s6 结果及判定36.1 数据表示以多数个体具有的谱带即主带作为品种的特征谱带,当无法判断主带时,给出各种谱带所占的比率。谱带记录方
9、式:每个核心引物的所有谱带按扩增片段从大到小的顺序编号,用二位代码描述(依次为01、02),并确定代表每条谱带的一套标准品种。每个待测品种在每个引物位点上的谱带号用四位代码描述,参照标准品种确定待测品种的谱带号。示例1:在一个核心引物上仅有一条谱带 02,品种在该引物位点的谱带代码为 0202; 示例2:在一个核心引物上有两条谱带 02 和 03,品种在该引物位点的谱带代码为 0203。6.2 检测及判定标准6.2.1 先用 17 对基本核心引物检测,获得待测品种在 17 个引物位点的 DNA 指纹谱带数据,利用 17 个位点的 DNA 指纹谱带数据进行品种间比较。亲缘关系较近难以区分时可附加
10、 17 个参考位点。a) 品种间差异位点数2,判定为不同品种;b) 品种间差异位点数1,判定为相近品种;c) 品种间差异位点数0,判定为相同或极近似品种。6.2.2 对 b 和 c 的情况,必要时继续用 17 对扩展核心引物进行检测,利用 34 个位点的 DNA 指纹谱带数据进行品种间比较:a) 品种间差异位点数2,判定为不同品种;c) 品种间差异位点数0,判定为相同或极近似品种。6.3 鉴定报告鉴定报告书格式见附录D。4b) 品种间差异位点数1,判定为相近品种;附 录 A(规范性附录) 仪器设备及试剂A.1 仪器设备A.1.1 PCR核酸扩增仪:规格为96孔;A.1.2 序列分析电泳槽;A.
11、1.3 高压电泳仪:规格为3000 V , 400 mA, 400 W ;A.1.4 水平摇床;A.1.5 胶片观察灯;A.1.6 电子天平;A.1.7 微量加样器;A.1.8 磁力搅拌器;A.1.9 高速离心机A.1.10 微量紫外分光光度计A.1.11 高压灭菌锅;A.1.12 pH酸度计。A.2 试 剂所用试剂均为分析纯,所用水均为去离子水。A.2.1 乙二胺四乙酸二钠;A.2.2 Tris碱;A.2.3 盐酸;A.2.4 氢氧化钠;A.2.5 10 Buffe:缓冲液;A.2.6 四种脱氧核苷酸:4 dNTP;A.2.7 Taq DNA聚合酶;A.2.8 SSR引物;A.2.9 矿物油
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