DB13_T1778-2013鱼类链球菌病诊断技术规范.pdf
《DB13_T1778-2013鱼类链球菌病诊断技术规范.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB13_T1778-2013鱼类链球菌病诊断技术规范.pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、ICS 67.120.30 B 50 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 17782013 鱼类链球菌病诊断技术规范 The norm of diagnosis technique for streptococcicosis in fish 2013-09-05 发布 2013-09-30 实施河北省质量技术监督局 发 布 DB13/T 17782013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位:河北省水产养殖病害防治监测总站。本标准主要起草人:侯金良、张志华、马瑞欣、李同庆、孙伟彬、邵铁凡、梁艳红、田洋、苏欢欢、薛政
2、。DB13/T 17782013 1 鱼类链球菌病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 病原菌 链球菌(Streptococcus)呈球形或卵圆形,在液
3、体培养基中以成对或链状出现;革兰氏阳性、触媒阴性、兼性厌氧;在血平板上通常溶血。引起鱼类链球菌病的有海豚链球菌(Streptococcus iniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、米氏链球菌(Streptococcus millieri)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)。其中海豚链球菌和无乳链球菌是引起鱼类链球菌病的主要病原菌。4 设备和材料 设备和材料包括:a)恒温培养箱。b)显微镜:10100。c)灭菌乳钵。d)天平:精度 0.1g。e)恒温水浴锅。f
4、)带有热盖功能的 PCR 仪。g)电泳仪。h)紫外分析仪或紫外观察灯。i)灭菌剪刀、镊子。j)高压灭菌器。DB13/T 17782013 2 5 培养基和试剂 培养基和试剂包括:a)水:应符合 GB/T 6682 的要求。b)Todd-Hewitt 肉汤(简称 THB)。c)血琼脂平板:按 GB/T 4789.28 中规定。d)75酒精。e)革兰氏染色液:按 GB/T 4789.28 中规定。f)3 H2O2 溶液(临时配制)。g)Taq DNA 聚合酶。h)酚/氯仿/异戊醇(25241)。i)琼脂糖。j)溴化乙锭(EB)。k)标准菌株:海豚链球菌和无乳链球菌标准菌株。l)dNTP:含 dAT
5、P、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 10mmol/L。m)PCR 引物:本标准以链球菌延伸因子(EF-Tu)tuf 基因设计一对引物。扩增片段大小为 639bp。使用时浓度为 10mol/L。其序列如下:E1:5GGACCAATGCCACAAACTCG3 E2:5TGGAGTATGACGTCCACCTTC3 n)DNA 分子质量标准(Marker)。o)无水乙醇:使用前预冷至-20。6 诊断步骤 6.1 活动情况观察 患病鱼游动缓慢,缺乏活力,分散于缓流处,浮于水面,或头向上尾向下呈悬垂状;临死前,病鱼或间断地狂游、翻滚、转圈。6.2 外部检查 患病鱼单侧或双侧眼球突出、充血,角膜混浊;
6、体色发黑,肛门红肿;鳃贫血,鳃盖下缘、胸鳍基部有出血现象;体表有 l 处或多处隆起,尤以尾部为多见,隆起部位出血或溃疡。6.3 解剖检查 患病鱼脑部充血,有出血点;肝脏肿大、出血,或脂肪变性、褪色;脾脏肿大,呈暗红色;胆囊、肾脏肿胀;胃肠或腹腔积水,肠壁充血发炎。6.4 病原菌的实验室常规鉴定 6.4.1 涂片检查 用 75%酒精棉球擦拭鱼体,在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官的小块组织,在洁净载玻片上涂片,风干后,革兰氏染色(按 GB/T 4789.28 中的规定)后镜检。如见紫色球菌则表明病料中可能含有链球菌。DB13/T 17782013 3 6.4.2 病原菌分离培养 对于有明
7、显症状的鱼,用经火焰灭菌并冷却的接种环于病灶或内部组织无菌取材后划线接种于血琼脂平板。对于无明显症状的鱼,在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官共 25g 组织匀质,加入 225mL灭菌的 THB 增菌液(见附录 A.1),28培养 242h 后,划线接种于血琼脂平板。将血琼脂平板于 28培养 24h 士 2h,如菌落生长缓慢,可延长至 48h 士 2h 后观察。6.4.3 菌落形态和显微镜观察 在血琼脂平板上如见灰白色、圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明或不透明、直径约0.3mm1mm、溶血或无溶血的菌落,则为可疑菌落。通过镜检如见成对或呈链状排列的圆形或近圆形、直径大小为 0
8、.2m1.0m 的细菌,则可初步鉴定为链球菌。6.4.4 病原菌生化鉴定 将可疑菌落做革兰氏染色、过氧化氢酶试验和葡萄糖发酵试验(按GB/T 4789.28中的规定),并将菌落接种于营养肉汤(见附录A.2)于10培养48h,观察是否生长。如革兰氏染色呈阳性,过氧化氢酶试验阴性,葡萄糖发酵试验阴性,10营养肉汤培养不生长,则可鉴定为链球菌。6.5 病原菌的聚合酶链式反应(PCR)方法鉴定 本方法与6.4的方法可任选其一。6.5.1 取样 解剖待检样品鱼,取脑、肾、肝和脾组织约 1.0g,于灭菌乳钵中充分研磨,再加 5.0mL TE 缓冲液(见附录 A.3)混匀,然后将组织悬液转入无菌离心管中。6
9、.5.2 模板 DNA 的制备 取组织悬液 90L 于 1.5mL 离心管中,加入溶菌酶 10L(10 mg/mL),37 水浴 1 h。加入蛋白酶 K 5L(20 mg/mL),37 水浴 1h,加入 RNA 酶 10L(10 mg/mL),37 水浴 30min,加入 150L苯酚氯仿异戊醇(25241)混合液抽提 3 次,然后加入预冷的无水乙醇,12000 r/min 离心 10 min,弃上清,自然干燥,用 100L TE 缓冲液溶解做为 PCR 反应模板 DNA 溶液,4 保存。也可以使用能够达到同种效果的商业化细菌DNA提取试剂盒。6.5.3 PCR 扩增 PCR 反应体系 50L
10、,10PCR buffer 5L,MgCl2(25mmol/L)4L,dNTPs(各 10mmol/L)1L,E1、E2 引物(10molL)各 1L,Taq DNA 聚合酶(5/L)0.5L,模板 DNA 溶液 2L,双蒸水 35.5L。PCR 反应条件为:94预变性 5 min;94变性 1 min,58退火 45 s,72延伸 1 min,共 35 循环;72延伸 10 min,最后 4保温。每次反应应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。将海豚链球菌或无乳链球菌标准菌株分别接种于THB增菌液中,28培养18h24h,摇匀后取1mL,用无菌生理盐水稀释至106108CUF/mL(约麦氏比浊度
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB13_T1778 2013 鱼类 链球菌 诊断 技术规范
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【Fis****915】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【Fis****915】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。