MSI诊断检测的方法和应用.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,MSI,诊断检测的方法和应用,主 要 内 容,微卫星不稳定的相关背景,MSI,的检测意义,MSI,检测方法,MSI,检测试剂盒,背 景 介 绍,微卫星不稳定性,(,microsatellite,instability,MSI),是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。,主要机制：,DNA,多聚酶的滑动导致重复序列中,1,个或多个碱基的错配,MS,同源重组导致碱基对的丢失和插入,1993,年，,Altonen,等首次发现，在,HNPCC,细胞中存在高频率的,MSI,。目前已发现,MSI,的肿瘤主要有,3,类：,一类为,HNPCC,病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为,MSI,；,另一类为散发性结直肠癌,这一类肿瘤发生,MSI,概率约,15,30,；,第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤,这一类肿瘤,MSI,发生频率相对较低。,背 景 介 绍,结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每年有,13,万,-16,万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。,HNPCC,是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结直肠癌是一个常染色体遗传疾病,目前研究表明微卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要机制。,背 景 介 绍,具有,MSI,的散发性结直肠癌,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为,:,发病年龄较小；对某些化疗药物,(,如,5-FU,、顺铂等,),有原发性耐药,;,生物学行为较好。,MSI-H,是,期结肠癌预后良好的一个标志物，也是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预测指标。,背 景 介 绍,微卫星不稳定检测的意义,1.,检测,MSI,可以用于检测是否为,Lynch,综合征,结直肠癌的遗传易感性包括一些研究较清楚的遗传性综合征，例如,Lynch,综合征（又称之为遗传性非息肉病性结直肠癌，,HNPCC,）和家族性息肉病（,FAP,）。在,HNPCC,和散发性直肠癌中的微卫星不稳定性是遍布整个基因组的现象，并且可能是导致癌症发生的普遍机制。,专家组推荐，,MMR,蛋白检测应强烈建议在所有,50,岁以下的结肠癌患者中开展，原因在于该群体中患,Lynch,综合征的可能性增加。而且，在一些中心，现在对所有的结直肠肿瘤组织进行免疫组化检测（有时分析,MSI,）以来决定哪些患者需要进行,Lynch,综合征相关的基因检测,.,微卫星不稳定检测的意义,2.,检测,MSI,可以用于判断患者预后,高危,期患者，定义为预后较差者，包括：,T4,（,B,、,C,期）、组织学分化差（,3/4,级，不包括,MSI-H,者），已经有大量证据表明,MMR,蛋白表达缺失或,MSI-H,是,期结肠癌预后良好的一个标志物。具有,MSI-H,肿瘤的,期结肠癌患者，,3/4,级分化（低分化）不再认为是高危因素。,微卫星不稳定检测的意义,3.,检测,MSI,以判断是否需要辅助化疗,对于,期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性（,MSI,）。,研究认为,MMR,基因为,MSI-H,（高度微卫星不稳定）会对顺铂、卡培他滨及,5-FU,产生耐药性，相反,MSI-L,、,MSS,的患者不会产生耐药。,微卫星不稳定检测的意义,一项研究长期随访了,/,期结肠癌患者后发现，,MSI-L,或,MSS,者通过,5-FU,辅助化疗确实改善了预后；然而，,MSI-H,者却不能从术后,5-FU,辅助化疗中显著获益，与单纯手术相比，,5-,年生存率反而更低。,微卫星不稳定检测的意义,MSI,检 测 方 法,1.,免疫组化方法,(IHC),免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的,MLH1,MSH2,MSH6,和,PMS2,蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了,MSI,。,2.,直接测序法,对,MMR,基因各区域（,MLH1,、,MSH2,、,MSH6,等）的扩增产物直接测序。,3.,多重荧光,PCR,采用多重荧光,PCR,的方法对,NCI,建议的位点进行扩增，以确定,MSI,状态。,检 测,MSI,方 法 比 较,方法,灵敏度,特异性,重现性,时间,成本,操作,IHC,90%,低,低,3-5,天,5001000,复杂,直接测序法,80100%,高,高,5-7,天,10002000,简便,多重荧光,PCR,100%,高,高,2-3,天,5001000,简便,Microread,MSI,检 测 试 剂 盒,阅微基因根据,NCCN,指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了,MSI,检测的试剂盒。,微卫星不稳定（,microsatellite,instability,，,MSI,）检测试剂盒是一款以多重荧光,PCR,技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测,6,个,MSI,位点，操作简便、快速。,扩 增 检 测 位 点,位点,GenBank,Number,重复序列,产物范围,1,标记荧光类型,NR-27,AF070674,(A),27,70-91,HEX,NR-21,XM_033393,(A),21,92-113,FAM,BAT-26,U41210,(A),26,160-185,FAM,BAT-25,L04143,(A),25,105-125,HEX,NR-24,X60152,(A),24,119-139,TMR,MONO-27,AC007684,(A),27,155-177,TMR,Penta C,AL138752,(AAAAG),3-15,190-250,FAM,Penta D,AC000014,(AAAAG),2-17,151-224,HEX,Amel,-,-,107/113,TMR,MSI,检 测 送 样 要 求,若客户提供石蜡切片，则要求厚度,5-20m,的石蜡切片（切片中确保含有,9mm,2,以上大小的组织块）,10,片或以上，注明石蜡包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。,若客户提供,DNA,样品，则从新鲜组织提取的,DNA,最佳，,20ng/l,以上的,DNA 20l,即可（需提供,DNA,浓度）；若为石蜡包埋组织提取的,DNA,，除了提供,DNA,的浓度（,20ng/l,以上的,DNA,至少,20l,）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图,MSI,检 测 试 剂 盒 使 用 方 法,DNA,提取：根据样本不同，采用二甲苯或,Chelex,100,的方法提取,DNA,；,PCR,扩增：,毛细管电泳检测：按照,（,0.5lROX500,）,样品数,+,（,8.5l,甲酰胺）,样品数,制备好样品，,RUN 3130 xl,遗传分析仪。,组分,20 l,体系,(l),Master Mix,无核酸酶超纯水,6.0,2.5PCR Mix,8.0,5MSI,引物混合物,4.0,模板,DNA,2.0,反应总体积,20.0,操 作 流 程 示 意 图,数 据 分 析,目的峰：,A.,单核苷酸标记的位点,NR21,、,Bat26,、,NR27,、,Bat25,、,NR24,、,Mono27,的峰型均为类似五指的手掌峰，见图,2,；,图,2,单核苷酸标记位点峰型示意图,B.,五核苷酸重复的位点,Penta,C,、,Penta,D,和性别位点,Amelogenin,的峰型均为单峰型，见图,3,。,图,3,五核苷酸标记和性别位点峰型示意图,非目的峰：,pull-up,峰、,stutter,峰、染料峰、加,A,不完全峰等。,数 据 分 析,MSI,判 定 结 果,微卫星不稳定,MSI-H,型,根据,NCI,建议，与正常样本比较，有,2,个发生改变可称定为,MSI-H,型，只有,1,个出现不稳定的为,MSI-L,型，没有出现突变的情况为,MSS,型。,微卫星不稳定,MSI-L,型,MSI,判 定 结 果,微卫星稳定,MSS,型,MSI,判 定 结 果,MSI,检 测 试 剂 盒 优 点,基于,MSI,的,NCI panel,标准开发了适合中国人群的,MSI,检测系统；,采用多重荧光,PCR,技术，一次扩增和检测,6,个准单态性单核苷酸微卫星基因座，其中,5,个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合中国人群的位点；,基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，已经做了超过,1000,例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。,MSI,检 测 案 例,XBH-X,XBH-1,*,接收委托方两份样本，正常组织,XBH-X,和肿瘤组织,XBH-1,，要求鉴定肿瘤组织的,MSI,状态，正常对照样本分型正确，肿瘤组织样品在,BAT-26,、,NR-27,、,BAT-25,、,NR-24,和,MONO-27,等,5,个位点出现双峰。该肿瘤组织为,MSI-H,型。,13MS6E,13MS6C,*,接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织,13MS6C,和正常组织,13MS6E,，要求检测该肿瘤组织的,MSI,状态，,6,个单核苷酸位点均未出现,MSI,，鉴定结果为,MSS,稳定状态。,MSI,检 测 案 例,阅 微 基 因 诊 断 试 剂 简 介,脆性,X,综合征检测试剂盒,五种特性检测脆性,X,综合征：准确计算,CGG,重复数、灵敏度高于,Southern,杂交、可识别女性纯合子及杂合子、检测,AGG,插入、结果,100%,可重复。,白血病,BCR-ABL1,检测试剂盒,检测三种最常见,BCR-ABL1,变体；可进行绝对定量；灵敏度达,10,-5,；,整合,ARQ,技术，检测结果稳定、准确；成本较低。,Y,微缺失检测试剂盒,操作简便；,8,小时内得到结果；模版需要量低；检测位点包含,EAA/EMQN,指导意见位点；每个样品只需一个扩增检测反应；可检测,AZFb,、,AZFc,区各常见部分缺失及复制；可同时对克氏综合症进行检测。,21,三体综合征检测试剂盒,周期短、准确性高、灵敏度高、可清晰判断样本污染情况、对于部分易位和嵌合体有更好的检出率,阅 微 基 因 诊 断 试 剂 简 介,Thank You!,