海洋生物技术实验ppt.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一、微藻原生质体的分离,实验目的,1.,了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术；,2.,熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。,实验原理,根据藻类细胞脱壁程度的不同，,Adamich,将脱壁后的藻细胞定义为原生质体（,protoplast,）和原生质球（,spheroplast,）。原生质体是指任何基因型的藻细胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。,海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是酶解的方法。,仪器与试剂,1,、,仪器,恒温水浴；,低速离心机；,冷冻离心机；,离心管,40-50ml;,三角烧瓶；,显微镜，荧光显微镜。,2,、试剂与酶,酶：纤维素酶（,Onozuka,R-10,）,离析酶；,浸透压调节剂：甘露醇、山梨醇和,Nacl,；,密度勾配剂,Ficoll,和蔗糖。,实验步骤,1,、藻株的培养；,2,、原生质体的分离；,（,1,）取对数期的培养藻细胞（浓度为,5107,细胞,/ml,）,10ml,离心沉淀（,1000g,5min,室温）。,（,2,）用加入,0.85mol/LNaCl,的,MBM,液洗沉淀的藻细胞一次（,1000g,5min,）。在相同的,MBM,液中加入,1%,纤维素酶和,0.5%,的离析酶。将洗好沉淀的细胞在,10ml,上述加酶的培养液中悬浮。,（,3,）在振荡器上缓慢振荡（,20-30,次,/min,）细胞悬浮液，,30,保温，,1000-2000lx,光照。,（,4,）在定时取出,1ml,处理样品，离心分离（,1000g,5min,），用,MBM,液（含,0.6mol/l,山梨醇）洗涤一次，离心沉淀后，用,MBM,液（含,0.6mol/l,山梨醇）重新悬浮。,（,5,）取,0.1ml,上述悬浮液再悬浮到,0.9ml,蒸馏水中，显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。,（,6,）,80%,以上细胞原生质体化后（,1-2h,）,将细胞悬浮液置于离心管中配制好的,Ficoll,不连续密度离心介质（,10%-25%,）的顶部，,10000r/min,离心,30min,。,（,7,）在,15%-20%,界面处回收原生质体，用,MBM,（含,0.6mol/l,山梨醇）液洗涤原生质体。,作 业,1,、影响微藻原生质体分离效果的因素有哪些？,2,、原生质体和原生质体球之间有何差异？,实验二、原生质体培养,实验目的,1,、学习掌握原生质体培养培养基的种类以及配制方法；,2,、熟练掌握原生质体培养的基本过程与技术要领。,实验原理,分离得到的原生质体如培养在合适的培养基和培养条件下，细胞壁可以再生，细胞可以增殖。原生质体再生的能力与原生质体化程度和酶处理时间呈反比关系。,仪器与试剂,1,、仪器,灭菌培养皿；,血球计数板，显微镜等；,试管（,12ml,的一次性使用塑料试管）。,2,、培养基,液体再生培养基：,MBM,加浸透压调节剂（,20%,蔗糖或,0.6mol/L,山梨醇），高压灭菌。,琼脂再生培养基：,MBM,加浸透压调节剂（,20%,蔗糖或,0.6mol/L,山梨醇）加,1.5%,琼脂。,实验步骤,1,、分离制备的,C.ellipsoidea,C-87,原生质体（,Ficoll,中），用两倍体积的液体再生培养基稀释；,2,、离心沉淀原生质体（,1000g,5min,），弃去上清液，用液体再生培养基再洗涤一次；,3,、用相同的培养基将原生质体重新悬浮。用血球计数板计数，使细胞密度达到,5107,个,/ml,；,4,、于,25,和光照,3000lx,条件下静置培养,3d,，然后取出合适密度（,104,个细胞,/,平板）原生质体与已冷却但尚未凝固的琼脂培养基（,0.6%,琼脂）混匀后，倒入培养皿使原生质体在平板上增殖；,5,、再生平板培养基增殖，此阶段细胞壁再生能力很强，如将培养基的糖浓度降低,50%,，可加快增殖速度；,6,、,25,光照下（,6000lx,）静置培养，,1-2,周后，出现藻落。,注意事项,通常,1-2,周后，再生率达,10%,（好的可达,30%,），这时可以从琼脂培养基上看到藻落出现。在没有渗透压调节剂的平板上，如果有藻落出现，则可能产生于自生孢子。用软琼脂培养基（,0.6%,琼脂）包埋原生质体的方法培养，再生频率高但藻落出现晚。液体再生培养基静置培养的原生质体，,2-3d,细胞壁即可再生。,作 业,1,、观察原生质体培养过程中，细胞形态特征的动态变化。,2,、原生质体培养与藻类培养有何差异？,实验三、海藻种内不同原生质体细胞融合与鉴定,实验目的,1,、了解原生质体细胞融合的基本原理；,2,、学习掌握诱导原生质体细胞融合的基本方法；,3,、熟练掌握原生质体细胞融合的操作过程。,实验原理,细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的细胞融合技术。,仪器与试剂,1,、仪器,采用的仪器与原生质体培养相同。,2,、藻株,C.ellipsoidea,C-87,细胞（,5107,个,/ml,细胞）经紫外线或,X,射线处理（,99%,死亡）后，接种于含葡萄糖的,MBM,平板培养基上，置暗处培养,4-7d,后，分离色素变异株（黄色,Yel,和白色,Whi,）。检测稳定性以及培养条件对色素变化的影响，分为不同的类型。,3,、培养基和试剂,（,1,）培养基用原生质体再生培养基。,（,2,）细胞融合溶液：,40%,聚乙二醇（,PEG,）,6000,0.55mmol/L,山梨醇，,50mmol/LCaCl2 2H2O,（,3,）清洗液：,0.6mol/L,山梨醇，,50mmol/L CaCl2.2H2O,，,50mmol/L,甘氨酸缓冲液（,PH9.0,）,实验步骤,1,、不同类型的色素变异株按实验二的方法制备原生质体。,2,、两种原生质体按,1:1,比例混合（,5107,个细胞,/ml,），离心（,1000g,，,5min,）。,3,、倾去上清液，向沉淀的原生质体中加入,1ml,细胞融合溶液，轻轻搅拌均匀。,4,、,30,静置,30min,，缓慢搅拌加入,1ml,洗涤液，,10min,后，搅拌再加入,2ml,洗涤液。,5,、,10min,后，加,2ml,原生质体培养液，离心洗涤（,1000*g,，,5min,）。用原生质体培养液重复洗涤,5,遍。,6,、弃去上清液，加,16ml,软琼脂培养液将原生质体悬浮后，每,2ml,倒一个平板。,7,、软琼脂平板在,25,，,1000lx,光照下培养。,作 业,1,、原生质体融合细胞检测鉴定的方法有哪些？,2,、原生质体融合技术有何应用价值？,实验四、海藻种间原生质体细胞融合与鉴定,实验目的,1,、了解种间原生质体细胞融合的基本原理；,2,、学习掌握诱导种间原生质体细胞融合的基本方法；,3,、深入了解种间原生质体细胞融合与种类原生质体细胞融合之间的差异。,实验原理,细胞融合实验中选择的亲本各自具有独特的识别标记，对融合后细胞的筛选十分重要，在实践中常用的选择标记有色素变异、营养要求不同、对抗生素耐性差异、菌落形状差异及特定酶活性等。这里以色素变异为选择标记介绍海洋微藻的细胞融合技术。,仪器与试剂,1,、仪器,采用的仪器与原生质体培养相同。,2,、藻株,盐藻,Dunaliella salina,LB200,和紫球藻,Porphyidium cruentum,161,为美国德克萨斯大学藻种，盐藻,Dunaliella bardawi,30861,为,ATCC,藻种。,3,、培养基和试剂,（,1,）培养基用原生质体再生培养基。,（,2,）细胞融合溶液：,40%,聚乙二醇（,PEG,）,6000,，,0.55mmol/L,山梨醇，,50mmol/LCaCl2 2H2O,（,3,）清洗液：,0.6mol/L,山梨醇，,50mmol/L CaCl2,2H2O,，,50mmol/L,甘氨酸缓冲液（,PH9.0,）,实验步骤,1,、藻体培养；,2,、原生质体分离；,（,1,）收集紫球藻处于指数生长期的细胞，用灭菌培养液离心洗涤,2,次。,（,2,）将藻细胞悬浮于,10ml,酶解液中。酶解液的组成是,0.6mol/L NaCl,、,0.4%,（,W/V,）果胶酶和,4%,（,W/V,）纤维素酶。,3,、原生质体融合：将紫球藻原生质体与盐藻原生质体,1:1,混合，然后加入等体积的,PEG,溶液（组成：,0.125mmol/L PEG 4000,，,0.2mol/L,葡萄糖，,10 mmol/LCaCl2.2H2O,0.7 mmol,/L KH2PO4,，,pH 5.8,）。,30min,后，加入,PEG,洗涤液（组成：,100 mmol,/L,甘氨酸，,mol/L,葡萄糖，,100 mmol,/L CaCl2.2H2O,，,pH 10.5,）。在,15min,内一滴一滴加入,2.5,倍体积的,PEG,洗涤液。洗涤过程中，原生质体融合发生。,4,、杂交频率的检测；,5,、融合细胞的筛选。,作 业,1,、什么叫原生质体融合？原生质体融合在藻类育种上有何意义？,2,、种间原生质体细胞融合后，杂交细胞的遗传组成与性状表现有何改变？,实验五、总,RNA,抽提与鉴定,【实验目的,】,1,、学习总,RNA,分离的原理,2,、掌握,Trizol,法总,RNA,提取的方法,3,、了解各种的不同总,RNA,提取方法,【实验原理,】,TRIZOL,试剂是直接从细胞或组织中提取总,RNA,的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持,RNA,的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。,RNA,存在于水样层中。收集上面的的水样层后，,RNA,可以通过异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的,DNA,和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出中间层的,DNA,，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化,DNA,对于样品间标准化,RNA,的产量十分有用。,无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织,(50-100 mg),和细胞,(5106),以及大量的组织,(1 g),和细胞,(107),均有较好的分离效果。,TRIZOL,试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。,TRIZOL,抽提的总,RNA,能够避免,DNA,和蛋白的污染。故而能够作,RNA,印迹分析、斑点杂交、,poly(A,)+,选择、体外翻译、,RNA,酶保护分析和分子克隆。如果是用于,PCR,，当两条引物位于单一外显子内时，建议用,DNase,I,来处理抽提的总,RNA,。,TRIZOL,试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种,RNA,。例如，从大鼠肝脏抽提的,RNA,琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于,7 kb,和,15 kb,之间不连续的高分子量条带（,mRNA,和,hnRNA,成分），两条优势核糖体,RNA,条带位于,5 kb(28S),和,2 kb(18S),，低分子量,RNA,介于,0.1,和,0.3 kb,之间,(tRNA,5S),。当抽提的,RNA,用,TE,稀释时其,A260/A280,比值,1.8,。,【实验器具,】,水平电泳装置，电泳仪、微波炉、紫外透射仪、微量移液器、一次性手套、离心管、离心管架、,Tip,头、高压灭菌锅、恒温摇床、台式冷冻高速离心机、研砵、液氨罐、医用剪刀、吸水纸、微量移液器、分光光度计等。,【试 剂,】,TRIzol,、,DEPC(,焦碳酸二乙酯,),、氯仿、异丙醇、无水乙醇、,75,乙醇、,TE,缓冲液、,TBE,电泳缓冲液（,5,）、,EB,、上样缓冲液、琼脂糖等,【操作步骤,】,1,、组织匀浆化：用,glass-Teflon,或强力匀浆器,(Polytron,或,Tekmars,TISSUMIZER,或,equivalent),搅匀组织样品，每,50,100 mg,组织加,1ml,的,TRIZOL,。匀浆化时组织样品容积不能超过,TRIZOL,容积的,10%,。（备选方案：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在,2,8C,的条件下以,12,000g,的离心力离心,10,分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量,DNA,，而上层的超浮游物含有,RNA,。在来自于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中，将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤。）,2,、分离阶段：将匀浆样品在,15,30C,条件下孵育,5,分钟以使核蛋白体完全分解。每,1 ml TRIZOL,加,0.2 ml,氯仿。盖紧样品管盖，用手用力剧烈摇晃试管,15,秒并将其在,30C,下孵育,2,3,分钟。在,2,8C,下以不超过,12,000g,的离心力高速冷冻离心,15,分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚,-,氯仿层，中间层，上层无色的水样层。,RNA,无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加,TRIZOL,容量的,60%,。,3,、,RNA,的沉淀：将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离,DNA,和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀,RNA,。最初均化时的每,1 ml TRIZOL,对应,0.5 ml,异丙醇的加入量。将混合的样品在,15,30C,条件下孵育,10,分钟，并在,2,8C,下以不超过,12,000g,的离心力高速冷冻离心,10,分钟。,RNA,沉淀在离心前通常不可见，离心后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。,4,、,RNA,的洗脱：移去上层悬液。用,75%,的乙醇洗涤,RNA,沉淀一次，每,1 ml,的,TRIZOL,至少加,1 ml,的,75%,乙醇。旋涡振荡混合样品并在,2,8C,下以不超过,7,500g,的离心力高速冷冻离心,5,分钟。,5,、,RNA,的再溶解：在操作的最后，简单干燥,RNA,沉淀（空气干燥或真空干燥,5,10,分钟），不要在真空管里离心干燥,RNA,。尤为重要的是，不能让,RNA,沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。用无,RNA,酶的水或,0.5%SDS,溶液来溶解,RNA,，可在,55,60C,下孵育,10,分钟，,RNA,还能用,100%,去离子甲酰胺溶解，,70C,保存。,6,、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总,RNA,配制,1.2%,变性琼脂糖凝胶,(40 mL,),称取,0.48 g,加入,DEPC,水,25.2 mL,5X,电泳缓冲液,4 mL,加热使溶解，稍冷却加入甲醛,3.4 mL,混匀，室温凝固,0.5-1 h.,RNA,电泳检测样品制备,RNA 2 l,甲醛,2.5 l,甲酰胺,7.5 l,10MOPS 2 l RNA Loading Buffer2 l,灭菌的,DEPC,水,4 l,混合液轻轻混匀并离心，放于,65,下温育,5 min,后，置于冰上。,电泳检测,将,1.2%,变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加,1MOPS,电泳缓冲液，覆盖凝胶约,1 mm,。将,RNA,样品加到凝胶点样孔中，在,5 V/cm,条件下电泳,30 min,，然后在,EB,中染色,15-20 min,，在紫外灯下观察提取的,RNA,的质量。,7,、核酸蛋白定量仪测定总,RNA,的纯度和含量：在超净工作台上吸取,95ul,无菌水到,EP,管中，加入,5l,总,RNA,溶液，充分混匀，在核酸蛋白定量仪上测定待测样品液在,260nm,、,280nm,、,230nm,的,OD,值。然后计算,RNA,的浓度，并分析其纯度。,计算浓度：对于,ssRNA,，,1.0 OD260=40ug/ml,。,测定纯度：纯的,RNA,溶液其,OD260/OD280,的比值应介于,1.8,至,2.0,，,OD260/OD230,的比值应大于,2.0,。,RNA,样品,OD260/OD280,的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于,2.0,，则可能被异硫氰酸胍污染。,OD260/OD230,的比值小于,2.0,时表明有小分子及盐存在。纯的,DNA,溶液其,OD260/OD280,应为,1.8,，,OD260/OD230,应大于,2.0,。,OD260/OD280,大于,1.9,时，表明有,RNA,污染，小于,1.6,时表明有蛋白质或酚污染。,OD260/OD230,小于,2.0,时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。,实验六 第一链,cDNA,合成,【实验目的,】,1,、掌握第一链,cDNA,合成的原理。,2,、掌握第一链,cDNA,合成的方法,【实验原理,】,所有合成,cDNA,第一链的方法都要用依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶,(,反转录酶,),来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒,(AMV),逆转录酶和从表达克隆化的,Moloney,鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒,(MLV),反转录酶。,AMV,反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于,RNA,的,DNA,合成,依赖于,DNA,的,DNA,合成以及对,DNA:RNA,杂交体的,RNA,部分进行内切降解,(RNA,酶,H,活性,),。,MLV,反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于,RNA,和依赖于,DNA,的,DNA,合成活性,但降解,RNA:DNA,杂交体中的,RNA,的,能力较弱,且对热的稳定性较,AMV,反转录酶差。,MLV,反转录酶能合成较长的,cDNA,(,如大于,2-3kb),。,AMV,反转录酶和,MLV,反转录酶利用,RNA,模板合成,cDNA,时的最适,pH,值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。,AMV,反转录酶和,MLV,反转录酶都必须有引物来起始,DNA,的合成。,cDNA,合成最常用的引物是与真核细胞,mRNA,分子,3,端,poly(A,),结合的,12-18,核苷酸长的,oligo(dT,),。以,RNA,分子为模板，合成出一条,DNA,链。形成的,DNA,是与,RNA,模板互补的，因而反转录产生的,DNA,分子称之为,cDNA,。,【实验器具,】,离心机、冰盒、口罩、手套、,EP,管架、超净工作台、移液器、,DEPC,处理过的枪头、,EP,管等。,【试 剂,】,5M-MLV RT Buffer,、,2.5mM dNTP,mix,、,RNase,抑制剂,(30U/L),、,M-MLV Reverse Transcriptase,、,Oligo(dT)18 primer,、,DEPC,处理过的水等。,【实验步骤,】,1,在,DEPC,处理过的,EP,管中加入约,0.1,2g,总,RNA,和,1l 0.5g/l,的,Oligo(dT)18 primer,，加,DEPC,水到,12l,，小心混匀，,70,保温,5,分钟（使总,RNA,变性，去除大部分的二级结构），立即浸入冰水中（使,mRNA,与,Oligo(dT,),退火）。,2,按次序分别加入下列试剂：,4l 5M-MLV RT Buffer,2l dNTP,mix(10mM),1l RNase,抑制剂,(20U/L),1l M-MLV Reverse Transcriptase(200U/L),3,小心混匀，室温离心,5,秒，将所有溶液收集到管底，,42,保温,1,小时。,4,70,处理,5,分钟，冰上冷却（使酶变性，）。,5,用于,PCR,扩增或,-20,保存备用。,