SN∕T 5096-2019 国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法.pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 50962019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法Real-time RT-PCR method for detecting Lone Star virus in ticks at frontier ports 2019-09-03 发布2020-03-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS 11.020C 62孤星病毒.indd 12019/9/12 14:00:53ISN/T 50962019前 言本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标
2、准起草单位:中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼和浩特海关。本标准主要起草人:刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。孤星病毒.indd 12019/9/12 14:00:531SN/T 50962019国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法1 范围本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法的检测对象、生物安全和 PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序。本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期
3、的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求SN / T 1293 国境口岸蜱类监测规程WS / T 230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用人间传染的病原微生物名录(中华人民共和国卫生部 卫科教发200615 号)3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 孤星病毒 Lone Star virus ;LSV布尼亚病毒科白蛉病毒属成员,是单股负链节段性 RNA 病毒,有 S、M 和 L 片段。其中,L 片段编码 RNA 依赖性 RNA 多聚酶,M 片段编码糖蛋白 Gn 和 Gc,S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。孤星病毒主
4、要经蜱传播,经蜱叮咬后,人可能出现蜱传斑点热等症状。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp :碱基对(base pair)Ct 值:循环阈值(cycle threshold)DEPC :焦碳酸乙二酯(diethyl pyrocarbonate)FAM :6- 羧基 - 荧光素(6-carboxy-fluorescein)RNA :核糖核酸(ribonucleic acid)ROX :6- 羧基 -x- 罗丹明(6-carboxy-x-rhodamine)RT-PCR :逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reation)孤星病毒.i
5、ndd 12019/9/12 14:00:532SN/T 509620195 检测对象5.1 国境口岸现场采集的蜱虫样本。5.2 疑似被蜱虫叮咬且不能排除孤星病毒感染的人员。6 生物安全和 PCR 防污染要求6.1 生物安全要求按照 GB 19489 和人间感染的病原微生物名录的要求,孤星病毒相关材料的生物安全要求如下:未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行;孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行;孤星病毒感染性材料运输和包装分为 B 类,UN 编号为 UN 3373。6.2 PCR 防污染要求PCR 防污染措施
6、按 WS / T 230 的规定执行。7 仪器7.1 荧光定量 PCR 仪。7.2 二级生物安全柜。7.3 高压灭菌器。7.4 -70超低温冰箱。7.5 冷冻离心机。7.6 旋涡振荡器。8 试剂8.1 DEPC 水DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。8.2 RNA 提取试剂盒QIAamp Viral RNA kit,详见试剂盒说明书,内含 AVL、AW1、AW2 和 AVE 等1)。a8.3 一步法荧光 RT-PCR 试剂盒Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit2)。b1) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效
7、果,则可使用这些等效产品。2) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。孤星病毒.indd 22019/9/12 14:00:533SN/T 509620198.4 引物和探针序列见表 1。表 1 引物和探针序列引物 / 探针名称序列(5-3)监测期FCTTCCTTAACCCTCAGATA扩增片段为 134 bpRCCTCTTTATGGTCCCTTAProbeFAM- TCATCAACATCTCGTCTCATTCGCT -BHQ1 注:探针的 5端标记的是 FAM 荧光报告基团,3端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其
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