MTT法检测细胞活力.ppt
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1、MTT法检测细胞活力法检测细胞活力甘肃中医药大学甘肃中医药大学VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o mMTT法目的和意义法目的和意义检测细胞存活和生长情况检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用用于评价药物产生的细胞毒作用VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m原理原理四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简称称称称MT
2、TMTT活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTTMTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(死细胞无此功能。二甲基亚砜(死细胞无此功能。二甲基亚砜(死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSODMSO)能溶解细)能溶解细)能溶解细)能溶解细胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在
3、胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,从而反映细胞的增殖情况。从而反映细胞的增殖情况。从而反映细胞的增殖情况。从而反映细胞的增殖情况。在一定细胞数范围内,在一定细胞数范围内,在一定细胞数范围内,在一定细胞数范围内,MTTMTT结晶物形成的量与活细结晶物形成的量与活细结晶物形成的量与活细结晶物形成的量与活细胞数成正比。胞数成正比。胞数成正比。胞数成正比。VisonL
4、earningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m活细胞+MTT琥珀酸琥珀酸脱脱氢酶氢酶紫蓝色结晶物FormazanVisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m贴壁细胞操作步骤贴壁细胞操作步骤1.1.接种细胞:用接种细胞:用接种细胞:用接种细胞:用0.25%0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,胰蛋白酶消化单层培养细胞,胰蛋白酶消化单层培养细胞,胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含血清的培养液配成用含血清的培养液配成用含血清的培养液配成用含血清的培养液配成单个细胞悬液单个细胞悬液单个细胞悬液单个细
5、胞悬液,以每孔,以每孔,以每孔,以每孔2000-30002000-3000个细胞接种于个细胞接种于个细胞接种于个细胞接种于9696孔培养板中,每孔体积孔培养板中,每孔体积孔培养板中,每孔体积孔培养板中,每孔体积90ul90ul。(边缘孔用(边缘孔用(边缘孔用(边缘孔用PBSPBS或空白培养基填充)。或空白培养基填充)。或空白培养基填充)。或空白培养基填充)。2.2.培养细胞:将培养板移入培养细胞:将培养板移入培养细胞:将培养板移入培养细胞:将培养板移入COCO2 2孵箱中,在孵箱中,在孵箱中,在孵箱中,在3737、5%CO5%CO2 2及饱和湿度条件下培养,至细胞单层铺满及饱和湿度条件下培养,
6、至细胞单层铺满及饱和湿度条件下培养,至细胞单层铺满及饱和湿度条件下培养,至细胞单层铺满孔底(孔底(孔底(孔底(9696孔平底板,大约孔平底板,大约孔平底板,大约孔平底板,大约12h12h),加入浓度梯度的),加入浓度梯度的),加入浓度梯度的),加入浓度梯度的药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药1010ulul,一般设,一般设,一般设,一般设5 5个复孔。个复孔。个复孔。个复孔。3.5%CO3.5%CO2 2,3737孵育分别孵育孵育分别孵育孵育分别孵育孵育分别孵育
7、2424小时后,倒置显小时后,倒置显小时后,倒置显小时后,倒置显微镜下观察。微镜下观察。微镜下观察。微镜下观察。VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m4.每孔加入每孔加入10ulMTT溶液(溶液(5mg/ml,即,即0.5%MTT),继续培养),继续培养4h。若药物与。若药物与MTT能够反应,能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲冲2-3遍后,再加遍后,再加入含入含MTT的培养液。的培养液。5.终止培养,小心吸去孔内培养液。终止培养,小心吸去孔内培养液。6.每孔加入每孔加入100ul二甲基亚
8、砜(置摇床上低速振荡二甲基亚砜(置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔(培养基、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),、二甲基亚砜),对照孔(细胞、培养液、对照孔(细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜)、二甲基亚砜)VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m悬浮细胞操作步骤悬浮细胞操作步骤:1 1)将细胞离心收集后,调节细胞悬液浓度大约)将细胞离心收集后,调节细胞悬液浓度大约)将细胞离心收集后,调
9、节细胞悬液浓度大约)将细胞离心收集后,调节细胞悬液浓度大约1101104 4/ml/ml,每孔先加细胞悬液每孔先加细胞悬液每孔先加细胞悬液每孔先加细胞悬液90ul,90ul,相应梯度的药物每孔相应梯度的药物每孔相应梯度的药物每孔相应梯度的药物每孔10ul10ul;共;共;共;共100ul100ul加入到加入到加入到加入到9696孔板(边缘孔用孔板(边缘孔用孔板(边缘孔用孔板(边缘孔用PBSPBS填充)。每板设对照。同时填充)。每板设对照。同时填充)。每板设对照。同时填充)。每板设对照。同时设置调零孔(培养基、设置调零孔(培养基、设置调零孔(培养基、设置调零孔(培养基、MTTMTT、二甲基亚砜)
10、,对照孔(细胞、二甲基亚砜),对照孔(细胞、二甲基亚砜),对照孔(细胞、二甲基亚砜),对照孔(细胞、培养液、培养液、培养液、培养液、MTTMTT、二甲基亚砜),、二甲基亚砜),、二甲基亚砜),、二甲基亚砜),每组设每组设每组设每组设5 5个个个个复孔。复孔。复孔。复孔。2 2)置)置)置)置3737,5%CO25%CO2孵育孵育孵育孵育2424小时,倒置显微镜下观察。小时,倒置显微镜下观察。小时,倒置显微镜下观察。小时,倒置显微镜下观察。3 3)每孔加入)每孔加入)每孔加入)每孔加入10ulMTT10ulMTT溶液(溶液(溶液(溶液(5mg/ml5mg/ml,即,即,即,即0.5%MTT0.5
11、%MTT),),),),继续培养继续培养继续培养继续培养4h4h4 4)每孔加三联裂解液(每孔加三联裂解液(每孔加三联裂解液(每孔加三联裂解液(10gSDS10gSDS,异丁醇异丁醇异丁醇异丁醇5ml5ml,10MHCl10MHCl0.1ml0.1ml用双蒸水溶解配成用双蒸水溶解配成用双蒸水溶解配成用双蒸水溶解配成100ml100ml)过夜,)过夜,)过夜,)过夜,第二天早晨置摇床第二天早晨置摇床第二天早晨置摇床第二天早晨置摇床上低速振荡上低速振荡上低速振荡上低速振荡10min10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测,使结
12、晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪仪仪仪OD570nmOD570nm测量各孔的吸光值。测量各孔的吸光值。测量各孔的吸光值。测量各孔的吸光值。VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m药物的配制浓度体积过滤VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o mMTT的配制的配制MTTMTT一般最好现用现配,过滤后一般最好现用现配,过滤后一般最好现用现配,过滤后一般最好现用现配,过滤后4 4 C C避光保存两周内有效,避光保存两周内有效,避光保存两周内有效,避光保存两周内有效,或配制成或
13、配制成或配制成或配制成5mg/ml5mg/ml保存在保存在保存在保存在-20-20度长期保存,避免反复冻融,度长期保存,避免反复冻融,度长期保存,避免反复冻融,度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当免分解。尤其当免分解。尤其当免分解。尤其当MTTMTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。变为灰绿色时就绝对不能再用了。变为灰绿色时就绝对不能再用了。变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTTMTT有致癌性,用的
14、时候小心有致癌性,用的时候小心有致癌性,用的时候小心有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的有条件最好带那种透明的有条件最好带那种透明的有条件最好带那种透明的簿膜手套簿膜手套簿膜手套簿膜手套.配成的配成的配成的配成的MTTMTT需要无菌,需要无菌,需要无菌,需要无菌,MTTMTT对菌很敏感;往对菌很敏感;往对菌很敏感;往对菌很敏感;往9696孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o
15、 k.c o m实验结果统计学处理所有数值以xs表示,应用SPSS软件进行方差分析,p0.05时为相差显著,p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线,专门公式求IC50(半数抑制浓度)。或计算抑制率。OD对照组-OD实验组抑制率%=OD对照组100%VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m实验结果统计学处理公式如下:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率VisonLearni
16、ngPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m举例药物浓度药物浓度0.10.1、0.010.01、0.0010.001、0.00010.0001、0.000010.00001、0.000001umol/l0.000001umol/l,稀释倍数为,稀释倍数为1010,最大浓度为,最大浓度为0.10.1,抑制率为,抑制率为0.950.95、0.800.80、0.650.65、0.430.43、0.210.21,0.060.06。代入。代入 计算公式:计算公式:Pm=0.95Pm=0.95Pn=0.06Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0
17、.21+0.06=3.1P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025IC50=0.00025VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m注意事项注意事项11 选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。选择适当的
18、细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。在进行在进行在进行在进行MTTMTT试验试验试验试验前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以前,对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定及不同接种细胞数条件下的生长曲线,然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。试验中每孔的接种细胞数和培养时间。试验中每孔的接种细胞数和培养时间。试验中每孔的接种细胞数和培养时间。2 2 设空白对照,设空白对照,设空白
19、对照,设空白对照,与试验平行设不加细胞只加培与试验平行设不加细胞只加培与试验平行设不加细胞只加培与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。养液的空白对照孔。最后比色时,以空白孔调零。VisonLearningPartnerw w w.r o c k h u t b o o k.c o m实验前应明确的问题实验前应明确的问题1.选择适当的细胞接种浓度。选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,一般情况下,一般情况下,一般情况下,9696孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有孔培养板的一内贴壁细
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