电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术ppt课件.ppt
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1、回顾Functional analysisState 1State 22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabase searchDifferential analysis?1.第四章第四章 电泳泳图谱的的图像分析及像分析及蛋白蛋白质消化技消化技术 2.蛋白蛋白质表达表达谱l使用2D凝胶的比较蛋白质组学 比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2D-SDS-PAGE,比较蛋白质点的图型。研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝胶蛋白质点图型分析软件工具。此外,也开发出保存这些信息的大批数据库。3.双向双向电泳分析泳分析软件件lImageMaster 2DElite(MelanieTM
2、)lPDQuest 6 0 l英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesisl德国Decodon GmbH的Delta 2D等4.l图像分析的基础:使用文件扫描仪,但最好使用CCD获得图型。程序首先评估凝胶的“特征”,他是指与凝胶本底相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋白质点。可以通过光密度(OD)、大小和体积(整个蛋白质点面积上的OD)来鉴定特征。这些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征比较的基础。5.第一第一节 电泳泳图谱的的图像分析像分析掌握:掌握:蛋白电泳图像分析系统熟悉:熟悉:使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检测,匹配 和分析了解:了
3、解:二维电泳蛋白谱数据库6.电泳图谱的图像分析简介what can we get from image analysis?双向凝胶双向凝胶电泳技泳技术是目前蛋白是目前蛋白质组研究的主研究的主要技要技术之一之一,双向双向电泳根据泳根据等等电点和分子量点和分子量可一次性分离数千种蛋白可一次性分离数千种蛋白质,经染色后蛋白染色后蛋白质再再PAGEPAGE上可形成密度不同、分布不均的上可形成密度不同、分布不均的复复杂点点图谱。如何有效的如何有效的对双向凝胶双向凝胶电泳泳图像分析,如何像分析,如何对图谱上的蛋白上的蛋白质点点进行行检测、定量、比、定量、比较、分析和分析和归类,挖掘有价,挖掘有价值的蛋白的
4、蛋白质点的信息点的信息是双向是双向电泳分析泳分析软件所要解决的件所要解决的问题。7.凝胶的凝胶的图像像处理分析及理分析及细胞蛋白胞蛋白谱的建立的建立 典型流程典型流程l凝胶凝胶图像的像的扫描:描:l图像加工:像加工:l斑点斑点检测和定量:和定量:l凝胶配比:凝胶配比:l数据分析:数据分析:l数据呈数据呈递(report)l2-DE数据数据库的建立:的建立:8.PDQuest 软件件简介介PDQuestPDQuest软件是件是显示(示(imagingimaging)、分析)、分析(analyzinganalyzing)双向)双向电泳泳图谱数据数据库查询的一的一个个软件包件包硬件:硬件:一定的电脑
5、配置,Pentirm 166处理器,64M内存,3G硬盘,1024*768分辨率,256色,SCI接口,windows操作系统软件:件:PDQuest双向凝胶图像分析软件,Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA9.PDQuest 软件的使用件的使用以以PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析分析软件件为例将双向例将双向电泳分泳分析的基本析的基本实验过程做一程做一简单介介绍。10.PDQuest 软件件PDQUEST 2-D分析分析软件系件系统和其他和其他2-D分析分析软件件系系统一一样,包括:,包括:一一 图象采集与加工:象采集与加工:二二 斑点斑点检测三三 斑点
6、匹配斑点匹配四四 数据分析及数据分析及输出出11.PDQuest 软件的使用http:/ images)13.1、扫描:凝胶染色后用凝胶染色后用扫描描仪扫描,透射模式,全彩描,透射模式,全彩RGB,RGB,分辨率分辨率为400dpi-800dpi400dpi-800dpi,尽量排除气泡,文件以,尽量排除气泡,文件以tifftiff格式格式保存。保存。2、图片加工:l在在PDQUEST 2-DPDQUEST 2-D分析分析软件中打开以件中打开以tifftiff格式保存的文件可格式保存的文件可以以。(单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“OpenOpen”命令,选择保存2-D图象文件的磁盘
7、、路径和文件名,双击文件名或单击“Open”以打开2-D图象文件,此时tiff格式保存的文件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的文件格式2D Scan2D Scan。)l单击工具工具栏上的上的control thecontrol the image displayimage display 图标,会,会出出现一个一个对话框,通框,通过改改变此此对话框的框的High High 和和LowLow的的值以以改改变明亮度。明亮度。14.15.l用工具用工具栏的的crop可以切割掉凝胶可以切割掉凝胶边缘没有蛋白没有蛋白质点的部分,以减少分析的复点的部分,以减少分析的复杂性,但要注意
8、性,但要注意对你你要分析的多要分析的多块凝胶凝胶图像最好是切割成同像最好是切割成同样大小。大小。(在操作(在操作时先先选择其中的一个凝胶其中的一个凝胶图象并象并选定要定要切割的区域,然后在切割的区域,然后在imageadvance cropsave imageadvance cropsave crop settingscrop settings下保存下保存cropcrop的的设定条件并定条件并输入保存的入保存的名称,其他的名称,其他的图象切割象切割时在在imageadvance imageadvance cropload crop settingscropload crop settings中
9、中选定先前保存的名称即定先前保存的名称即可可 )16.图象采集与加工后就要象采集与加工后就要进行斑点行斑点检测,PDQUEST 2-D分析分析软件通件通过一个称之一个称之为“蛋白蛋白质斑点斑点检测向向导(spot identification wizard)”的程序来的程序来实现的。的。二、斑点检测(spots detection)17.l单击“spot”菜单,选择“spot identification wizard”程序。l该程序首先需人工需人工设定定检测参数参数如最小斑点、最弱斑点、最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的灵敏度,若检测效果不理想,该步骤可反复进行。程序允许人
10、工调节脱尾(streaks)、背景、斑点(speckles)和其他一些选项等。l这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象会显示检测到的斑点会用“字(Spot Crosshairs)”表示,检测的蛋白的蛋白质斑点斑点应尽量与肉眼尽量与肉眼观测的相符。的相符。l在Parameter Set 项输入保存的名称,蛋白质斑点的参数可被保存,并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑点,单击Process all gels,会出现一个Auto-detect spots窗口,其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象(这些凝胶图像需事先打开)。l蛋白质斑点检测完了之后,软件会
11、自动创建另外两种格式分别为gel image 和和gel spot。18.19.20.l由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点,比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在匹配之前最好进行处理,同时将gel scan、gel image 和gel spot图打开,然后单击edit spot tool,出现一个对话框,此对话框中有增加斑点(make a spot at cursor),删除斑点(remove spot at cursor),合并斑点(combine spot in box)等图标,可根据你的目的而选择其中一个图标进行相应
12、的斑点处理。这些处理只能在gel image图象中处理,但相应的在gel spot图象中会同时得到显示。21.22.u蛋白质斑点检测完了之后,为了比较和分析不同凝胶中蛋白质斑点的改变,PDQUEST 可以建立一个建立一个Matchset。单击matchcreat matchset,出现一个Matchset的对话框,输入文件名称,保存路径,选择(select)或上载(load)gel spot 图像的文件名,然后单击creat,出现一对话框,选择其中的一个图象做为参考图象(standard member),整个Matchset用单个窗口(signal window)来表示,其中的亚窗口(subw
13、indow)分别用来表示参考图像(用REF来表示)和成员胶(member gel)图像。三、斑点匹配(Matching spots)23.24.25.Matchset 建成后,接着便是建成后,接着便是设立标志点(landmark),它它的作用是的作用是对整个凝胶上蛋白整个凝胶上蛋白质斑点斑点进行排列(行排列(align)与定位)与定位(position)以便)以便进行匹配(行匹配(match)。)。单击工具工具栏中的中的match tools图标会出会出现一个窗口,其中有一个窗口,其中有 landmark,unlandmark,match gel,match all gels等斑点匹配的等斑点
14、匹配的工具工具,在在match菜菜单中也有中也有这些工具。些工具。标志点志点应选择分辨良好,且所有成分辨良好,且所有成员胶上均出胶上均出现的蛋白的蛋白质斑点,斑点,并尽量避开蛋白并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方,最好在不同的放大倍数下斑点聚集的地方,最好在不同的放大倍数下确定确定该蛋白蛋白质斑点斑点为所有成所有成员胶上同一个蛋白胶上同一个蛋白质斑点。至少要斑点。至少要设立两个立两个标志点后便可利用志点后便可利用PDQUEST的自的自动匹配功能来完成匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点个数为总斑点的10%左右,要用肉眼检查每一个
15、应该能匹配上的斑点是否匹配上了。26.27.28.u对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能,单击viewinterchange all images,这样所有的成员胶和参考胶有Gel spot 状态下变成了Gel image,而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以以编辑蛋白蛋白质斑点斑点。29.30.四、数据分析及输出(analysis and report)31.为了分析蛋白质斑点之间差异表达,PDQUEST提供了多个分析程序,包括蛋白质斑点量量(Quantity)分析分析,散点图工具(Satter Plot
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