SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.ppt
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1、 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量定蛋白质分子量 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个重要实验之生物化学实验技术教学中一个重要实验之一。一。能够带动生化实验技术综合型能够带动生化实验技术综合型实验项目的开设。实验项目的开设。如:蛋白质盐析沉淀提取如:蛋白质盐析沉淀提取 葡聚葡聚糖凝胶层析分离糖凝胶层析分离 DEAE-纤维素分离纤维素分离提纯蛋白质提纯蛋白质 蛋白质纯度鉴定、蛋白蛋白质纯度鉴定、蛋白质分子量测定等。质分子量测定等。一、实验目的一、实验目的l通通过过该该实实验验使使学学生生掌掌握握SDS-P
2、AGESDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理;测定蛋白质分子量的原理;l掌掌握握该该技技术术的的操操作作方方法法(基基础础性性很很强,使用范围宽阔强,使用范围宽阔;l运运用用SDS-PAGESDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量及染色鉴定。及染色鉴定。二、实验原理二、实验原理 l带带电电质质点点在在电电场场中中向向带带有有异异相相电电荷荷的的电电极极移移动动,这种现象称为这种现象称为电泳电泳。l电泳分类:移动界面电泳、区带电泳等。电泳分类:移动界面电泳、区带电泳等。l区区带带电电泳泳 是是在在半半固固相相或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液,然然后
3、后加加电电场场,分分子子在在支支持持介介质质上上或或支支持介质中迁移。持介质中迁移。区带电泳使用不同的支持介质,有区带电泳使用不同的支持介质,有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,现在则多用现在则多用聚丙烯酰胺(聚丙烯酰胺(PAGEPAGE)和和琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶。(一)分类(一)分类 PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应,分分为为连续系统和不连续系统连续系统和不连续系统两大类:两大类:1.1.连连续续系系统统:电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度相相同同
4、,带带电电颗颗粒粒在在电电场作用下,场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。主要靠电荷和分子筛效应。2.2.不不连连续续系系统统:由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分、pHpH、凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性,带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应,分分子子筛筛效效应应,还还具具有有浓浓缩缩效效应应,因因而而其其分分离离条条带带清清晰度及分辨率均较前者佳。晰度及分辨率均较前者佳。(二)特点:(二)特点:SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDSSDS(十二(十二烷基磺酸钠
5、)。烷基磺酸钠)。蛋蛋白白质质在在一一定定浓浓度度的的含含有有强强还还原原剂剂的的SDSSDS溶溶液液中中,与与SDSSDS分分子子按按比比例例结结合合,形形成带负电荷的成带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。蛋蛋白白质质丧丧失失了了原原有有的的电电荷荷状状态态形形成成仅仅保保持持原原有有分分子子大大小小为为特特征征的的负负离离子子团团块块,降降低低或或消消除除了了各各种种蛋蛋白白质质分分子子之之间间天然的电荷差异天然的电荷差异,因此在进行电泳时,因此在进行电泳时,蛋白质分蛋白质分子移速度取决于分子大小。子移速度取决于分子大小。当分子量在当分子量在15000Da15000Da到
6、到200000Da200000Da之之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数数呈线性关系呈线性关系。合下式:合下式:,式中,式中 将已知分子量的将已知分子量的标准蛋白质的迁标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图移率对分子量对数作图,可获得一条,可获得一条标准曲线标准曲线,未知蛋白质在相同条件下,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。在标准曲线上求得分子量。图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 94 00062 00043 00031 00020 10014 40
7、0胶槽123注:胶槽1 标准蛋白;胶槽2、3 样品蛋白得到同行专家赞 采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法测测蛋蛋白白质质分分子子量量时时,必必须须完完全全打打开开蛋蛋白白质质之之间间的的二二硫硫键键,使使蛋蛋白白质质分分子子被被解解聚聚,SDSSDS才才能能定定量量地地结结合合到到亚亚基基上上。因因此此在在用用SDSSDS处处理理样样品品同同时时用用巯巯基基乙乙醇醇处处理理。巯巯基基乙乙醇醇是是一一种种强强还还原原剂剂,它它使使被被还还原原的的二二硫硫键键不不易易再再氧氧化化,从从而而使使很很多多不不溶溶性蛋白质溶解而与性蛋白质溶解而与SDSSDS定量结合。定量结
8、合。三、三、实验试剂和器材实验试剂和器材 材料 实验试剂 1.低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l蒸馏水,置-20保存,使用前室温融化,沸水浴中加热3-5分钟后上样。样品1:称3mg样品1,加2 ml蒸馏水溶解。2.30%丙烯酰胺(Acr):称Acr30g,甲叉双丙烯酰胺 (Bis)0.8g,加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中 3.10%SDS(十二烷基磺酸钠)4.1.5mol/L p
9、H8.8 Tris-HCl缓冲液:称取Tris18.2g(PH计)(7 7)10%10%过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)(8 8)TEMEDTEMED(四甲基乙二胺)(四甲基乙二胺)(四甲基乙二胺)(四甲基乙二胺)(9 9)样品溶解液:)样品溶解液:)样品溶解液:)样品溶解液:SDSSDS(100mg100mg)+巯基乙醇(巯基乙醇(巯基乙醇(巯基乙醇(0.1ml0.1ml)+溴酚蓝(溴酚蓝(溴酚蓝(溴酚蓝(2mg2mg)+甘油(甘油(甘油(甘油(2g2g)+0.05mol/L pH8.0Tris-+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl HCl(2ml2ml),最后定
10、容至),最后定容至),最后定容至),最后定容至10ml10ml。(1010)固定液:取)固定液:取)固定液:取)固定液:取50%50%甲醇甲醇甲醇甲醇454ml454ml,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸,冰乙酸46ml46ml混匀。混匀。混匀。混匀。(1111)染色液:称取考马斯亮蓝)染色液:称取考马斯亮蓝)染色液:称取考马斯亮蓝)染色液:称取考马斯亮蓝R250 0.125gR250 0.125g,加上述固定,加上述固定,加上述固定,加上述固定液液液液 250ml250ml,过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。过滤后备用。(1212)脱色液:冰乙酸)脱色液:冰乙酸)脱色液:冰乙酸)脱色液:冰乙酸75m
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