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全自动加样仪的应用
李荣 庞丽丽 杜新凤
广西玉林市中心血站 537000
关键词 全自动加样仪 自动化 血液检测
随着人们对安全输血问题的日益重视，采供血机构的质量保证工作已成为其关注焦点，全面质量管理的理念使血液的质量保证已不局限于对其最终的检查，而依赖于对生产过程的每一个环节加以控制。自动化设备如全自动加样仪解决了大量标本加样和数据传输的问题，通过实验室管理系统软件与其它检测设备连接，最终与局域网联网，使操作过程标准化、规范化，大大减轻了工作人员的工作强度、降低职业暴露的机会并减少了人为误差，提高了实验室检测的准确度和特异性，有效的保证血液检测质量。笔者根据实际工作经验并参照有关文献，从全自动加样仪的概况、发展、应用等方面加以综述。
第一代多功能（Robotic）样本处理机，是由瑞士哈美顿（HAMILTON）公司开发于1985年上市的Microlab 2200。这是一台基于机械臂运动和具有管路系统的稀释分配器（Diluter）原理，采用8或12根固定距离的特弗隆探针，由单任务的BASIC程序控制的样本处理机。全自动酶免分析仪器的开发已经历了15年历史，与生化分析自动化不同，酶联免疫反应是在预先包被了试剂的96孔酶标板上进行，加样速度越快，每个标本的孵育时间一致性越高，孔间差异越小。因此，医疗器械厂商不得不开发独立的、8—12通道的全自动样本处理机来满足这一技术要求。这就是“前处理设备”概念的由来。随着样本处理自动化的技术进步，如今的“前处理”已不仅仅是ELISA实验自动加样，而是集ELISA实验、标本留样存档（Archiving）、血型正／反定型和RhD定型、转氨酶（ALT）和梅毒凝集实验、NAT汇集实验、DNA纯化、PCR加样、DNA测序加样、克隆快速筛选分配、药物筛选自动分配等多用途于一体的智能化、自动化样本处理机。
1 ELISA试验 尽管在90年代初期，由于以聚合酶链反应（PCR）技术为代表分子生物学水平技术的发明，人们纷纷预测，酶免试验将被更高灵敏度、数百万级信号放大的、病原体水平检测的核酸检测（NAT）所取代。ELISA试验仍然是传染病血清学标志物（如肝炎、艾滋、致畸病原Torch）、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的主导技术，它检测的是免疫抗原或抗体，NAT检测的是病毒核酸，两个方法对同一份标本的检测是互补的[1]，NAT法虽然灵敏度更高，但据报道抗-HCV阳性而HCV核酸检测阴性的血液亦能使受血者感染，也就是说NAT亦会有部分弱阳性标本漏检；HIV DNA测不出不能说明HIV感染已消失，因为HIV还存在于人体的CD4淋巴细胞和其它细胞、组织、器官中，而且在停药治疗后HIV RNA水平还可能反弹，所以抗-HIV阳性（经确证）在目前还是我国诊断HIV感染的主要指标。我们应当充分利用两种方法优势互补作用用于血液筛查，不能互相代替[2,3]。
全自动加样仪与全自动酶免分析仪(后处理)——如瑞士Hamilton公司制造的FAME、Tecan公司生产的BEPⅢ等连接，这就是全自动酶免分析系统，实现了ELISA试验从标本加样、稀释到酶标孵育、洗板、加试剂、读数和结果打印全自动。
2 病毒核酸检测（NAT） 随着科学技术的发展，输血传染病的检测技术也在不断进步，如化学发光免疫法（CLIA）、NAT也逐步引进和应用。核酸检测能大大缩短窗口期、避免病毒变异和免疫沉默性感染等造成的漏检，在欧美等发达国家，NAT已成为常规血液筛查技术。我国自2000年起即已有人对献血者HCV NAT筛查的必要性和可行性做了初步探讨，现在国家也将NAT纳入新的输血技术操作规程，部分采供血机构也开展一些病毒的核酸检测。鉴于我国各地采供血机构发展不平衡，在献血者中全面推广应用NAT技术尚存在技术、资金等问题。但血液行业是一个特殊的行业，正如美国AABB出版的《新千年血液》所言：“极少有其它某个行业能够像血液制品行业这样，始终处于公众、新闻媒体、乃至政府高官的密切关注之下。当发生血液安全问题时，往往激发出极其独特的情绪化反应，其强度常超过其它更大的公共卫生问题[4]。”我国采供血机构实施HBV、HCV、和HIV病毒核酸检测或许是发展方向，但有关技术问题如试剂的灵敏度和实验的准确性、标本汇集检测的限度等还有待解决。
NAT血液筛查主要有单个样品（ID-NAT）和多样品汇集（MP-NAT）两种模式，目前大多采用多样品汇集模式[5]，这是由我国的国情所决定。有研究[6]在已有加样设备基础上开发自动标本汇集，在MPLC上进行全自动核酸提取，最后在COBAS AMPLICOR上扩增和检测，实现从标本准备、核酸提取及扩增和检测一体化和自动化。
3 ALT检测 对献血者血液丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotrasferase ALT)检测的意义虽然存在很大的争议，但ALT目前仍是我国采供血机构献血者必查项目之一。《献血者健康检查要求》[7]规定酮体粉法只限于ALT初检使用，复检必须用赖氏法或速率法。由于全自动生化分析仪价格昂贵还不能在中小血站普遍推广，所以不能使用FICC推荐的速率法，多数还是采用赖氏试管法，操作烦琐，费工费时，不适宜大批量标本的检测，而且无法对原始数据进行网络化管理。利用全自动加样器加样，结合微孔板、酶标仪以及局域网从而实现ALT的自动化检测。与传统赖氏法比较，微孔板法可实现自动化，具有测量速度快、操作简便的优点，虽然由于标本、试剂用量小容易出现误差，且受脂肪血和溶血的影响较大[8]，但只要加以制，还是能满足质量要求。现在多数中小血站都采用赖氏微孔板法检测献血者ALT。
4 血型自动化检测 以前采供血机构实验室多使用手工法玻片（纸板）法或试管法作ABO正反定型和RhD血型筛查，操作烦琐，每天大量的标本做得手酸眼花，错型、误报等差错时有发生。利用全自加样仪处理样本，用微孔板法对献血者血液样本进行ABO及RhD血型筛查，血液标本、试剂红细胞、标准血清等均由全自动加样仪完成，即便是用人工判读结果，也减少了大量烦琐的手工操作，实现血型检测的自动化；由于全自动加样仪加样精度高，保证了实验结果的重复性，实现了血型检测的标准化[9]。如果再配以全自动血型分析仪（如国产爱康智能血型分析仪），利用其判读系统所具有的自动读取自动加样仪生成的条码，并有影像记录，保存原始数据，便于查询和溯源；通过局域网自动发布结果，实现了血型检测的数字化和规范化，避免人为因素对血型检测结果的影响，提高工作质量，并可减轻劳动强度，提高工作效率，还可大量节约试剂[10]，尤其适合采供血机构大批量标本血型筛查。有关权威人士认为[11]，自动化检测可检出ABO亚型及相应盐水不规则抗体，从而保障输血的安全性和有效性，但微孔板的自动判读与肉眼判断结合还是必须的，特别是亚型。
5 标本留样存档 我国《血站管理办法》第三十一条规定：血清（浆）标本的保存期应在血液使用后2年。一般血站保存的血样为血袋小辫，先离心后热合，由于小辫软而不直，即使充分离心，仍有血样中红细胞不能完全下沉的现象，致使保存的血浆辫中混杂红细胞，冷冻后溶血，影响标本质量。采用保存板（Archive plare，孔深35㎜，孔容量1.5ml）结合全自动加样仪和条形码技术留取血样（血清/浆），通过电脑记录留样信息并生成详细的留样文件，使血样保存板和加样文件形成一一对应的关系，确保留样的准确、可靠，便于查找，具有简单快捷、效率高且质量好、保存量大的特点[12,13]。更重要的是微板留样确保检测标本与留样标本一致，对实验室来说是一种有效的自我保护。但有报道[14]微板留样会造成弱阳性标本OD值显著下降，因此在微板留样的同时不能舍弃血袋上的小辫标本。
6 其它 DNA纯化、PCR加样、DNA测序加样、克隆快速筛选分配、药物筛选自动分配、梅毒凝集实验等等。
发展到今天的全自动加样仪其功能越来越功能强大，能满足医院和采供血机构的不同需求，可使用96孔板、384孔板、120孔血型板或非标准微板、试管、试纸等。完全可以有理由相信，全自动加样仪以其高度智能化和自动化的特点，将在现代实验室得到更广泛应用。

参考文献
1 吴剑媚,张庆武.核酸检测技术在血液病毒筛查中的应用[J]. 临床输血与检验,2008,10(1):86-90
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3 季阳,郑忠伟,蔡辉,等.病毒血清学检测与核酸检测技术在输血传染病筛查中的应用[J]. 中国输血杂志,2010,23(6):413-416
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7 中华人民共和国国家标准《献者健康检查要求》，GB18467-2001
8 陈惠民,吴丽惠.丙氨酸氨基转移酶3种方法检测结果比较[J]. 中国输血杂志,2007,20(56):382-383
9 赵树铭,张循善.关于红细胞ABO血型鉴定规范化的思考及建议[J]. 中国输血杂志,2009,22(6):431-433
10 王福成,施之雍,蔡隽,等.梯形微板技术在ABO血型检测中的应用[J]. 中国输血杂志,2007,20(1):53-54
11 周筱嫣,向东,徐忠,等. ABO血型自动化检测[J].中国输血杂志,2010,23(3):205-206
12 潘海平,吴玉清,赵林.应用全自动加样仪留取血样的探讨[J]. 中国输血杂志,2007,20(2):142-143
13 曹庆宏,王子成,朱广亮,等.保存板在保存血样中的应用[J]. 中国输血杂志,2001,14(6):374
14 王旭安,方昌志,简雪平,等.保存后的微板留样血液检测结果分析.中国输血杂志,2010,23(4):304

呼吸机管道定植菌与呼吸机相关性肺炎的临床研究
李 松
东莞市石龙人民医院儿科 广东 东莞523326
摘要：目的 分析气管插管机械通气患儿管道内细菌定植引起呼吸机相关肺炎的临床研究，为临床预防VAP的发生提供可靠依据。方法 对ICU中30名机械通气患者收集1、3、7天呼吸道分泌物及导管剪切送检培养，分析定植菌种类、定植时间。结合临床表现及辅助检查结果，将有无出现定植菌并发VAP分为定植菌组(未发生VAP)及VAP组。 结果 气管插管中1，3， 7天细菌定植分别占5%，30%，33%，出现VAP分别占0，8.3%，30%. 结论 上机时间越长，细菌定植机会越大，并发呼吸机相关性肺炎越大。
关键词：定植菌；呼吸机相关性肺炎 ；菌株
呼吸机相关性肺炎(ventilator-associatedpneumonia,VAP)是指气管插管,使用机械通气48小时后发生的肺炎。其发生率和病死率较高,治疗困难。本文就2009年1月—2011年1月本科NICU呼吸机上机患儿进行管道培养分离病菌，现分析报道如下。
1．临床资料
1．1一般资料 30例气管插管病例均来自我院2009年1月—2011年1月NICU病房住院的危重新生儿，其中男18例，女12例，,诊断新生儿肺透明膜病12例，HIE3例，肺出血2例，颅内出血5例，颅内感染2例，新生儿肺炎5例。
1．2 诊断标准 诊断标准　根据《医院获得性肺炎诊断和治疗指南》的诊断标准[1]：（１）使用机械通气４８ｈ以上或撤机拔管４８ｈ内；（２）与机械通气前胸片比较出现新的或进行性增大的肺部浸润影；（３）肺实变体征和（或）闻及湿啰音，并具备下列条件之一者：（１）白细胞总数大于１０．０×１０９／Ｌ或小于４×１０９／Ｌ，伴或不伴核左移；（２）体温大于３８℃；（３）呼吸道有脓性分泌物；（４）起病后从支气管分泌物中找到新的病原体。
１．３　标本采集　对接受呼吸机治疗的病例按有无出现定植菌并发VAP分为定植菌组及VAP组，分别在上24小时内及3、7天呼吸道分泌物及导管剪切送检培养，取得标本共180份，进行细菌分离培养及药敏试验。
2．结果
2．1 上机第一天60例标本共分离定植菌株3株，无出现VAP病例，上机第3天60例标本分离定植菌株18株，并发VAP5株，第7天分离定植菌株20株，并发VAP18株（表1）。
2．2 菌株构成中，革兰阴性杆菌40株，占 62.5% ，革兰阳性球菌20株，占31.2%，真菌4株，占6.3%(表2)。
表1上呼吸机1、3、7天患儿细菌培养定植菌组与定植菌并发VAP组菌株比较

分组
1(天)

3（天）

7（天）

阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
阴性
定植菌组
3
57
18
42
20
40
VAP组
0
60
5
55
18
42
χ2
3.077

9.09

0.154

P 值
>0.05

<0.01

>0.05

表2上机呼吸机患儿细菌培养菌株构成比

细菌名称 菌株数 构成比

革兰阴性杆菌 40 62.5%
肺炎克雷伯菌 14 21.8%
大肠埃希菌 11 17.2%
铜绿假单胞菌 8 12.5%
醋酸钙不动杆菌 5 7.8%
阴沟肠杆菌 2 3.1%
革兰阳性球菌 20 31.2%
金黄色菌葡萄球菌 9 14.1%
表皮葡萄球菌 6 9.4%
溶血葡萄球菌 2 1.6%
肺炎链球菌 1 1.6%
粪肠球菌 1 1.6%
腐生葡萄球菌 1 1.6%
真菌 4 6.3%
白色念珠菌 4 6.3%

3讨论
临床上发现，气管插管的患儿管道培养中有菌，但未引起相关感染症状，这部分菌通常为定植菌。定植菌在医院感染中起到的作用越来越得到重视，国内学者对新生儿定植菌的研究已有不少相关的报道[2]，认为患儿病情严重度相关的因素均与患儿获得细菌定植相关，胎龄越小，体重越低的早产儿，所受到的侵入性操作、暴露于侵袭性装置也越多，且长时间应用抗生素、住院时间长，使细菌定植机率大大增加。
宫内的环境是无菌的，新生儿的细菌的定植是一个正常的过程。正常足月儿围生期从产道获得细菌定植，生后通过喂养、从护理人员以及周围环境中获得细菌的定植。研究发现，生后从鼻部以及脐部获得表皮葡萄球菌以及a溶血链球菌的定植，在生后第2天或第3天时咽部获得革兰氏阳性球菌的定植，在生后2天末胃肠道获得肠球菌以及大肠杆菌的定植[3]。
定植与感染有着密切的关系，一种细菌在NICU病房中的定植率往往代表了发生该细菌感染的风险性。据国外资料定植耐甲氧西林金葡菌(MRSA)者发展为感染的风险是11%～38%,产ESBLs革兰阴性杆菌是25%。在获得病原菌的定植后，发生感染的风险性就提高了。来自于ICU成人患者的研究认为，对于呼吸机相关肺炎(VAP)来说,胃肠道内定植的革兰阴性菌是感染的来源,而护理人员手上暂时携带的病原菌则起到协助传播的作用。
上呼吸机的患儿极易造成细菌定植，本资料VAP发生率与与国内[4]报道的相仿，上呼吸机1天内标本细菌培养发现定植菌占5%，且无一例出现呼吸机相关肺炎，3天后这种状况发生变化，定值菌检出率占30%，且出现部分定植菌引起呼吸机相关肺炎症状，7天后定植菌占33%，表明大部分定植菌已引起VAP，感染与定植菌本身已无明显区别。定植菌随着上机时间的延长有明显的变化：在上机24小时内第一次采集的标本中，只分离出3例定植细菌，可能是呼吸机管道消毒不严或被外源性细菌污染，.在上机第3天，在呼吸机管道内分离出定植菌共23株，但其中有5株归为VAP菌株了，在上机第7天分离出有20株定植菌，18株VAP感染细菌，表明定植菌转化为对机体危害的致病菌了。
VAP感染病例菌种分析区域差别很大，优势菌也有所不同。本资料研究中，优势菌以条件致病菌多，革兰阴性杆菌40株，占62.5% ，革兰阳性球菌20株，占31.2%，真菌 4 株，占6.3%，优势菌前五位分别为，肺炎克雷伯占21.8%，其次是大肠埃希氏菌占17.2%，
金黄色菌葡萄球菌占14.1%，铜绿假单胞菌12.5%，表皮葡萄球菌占9.4%。肺炎克雷伯菌是条件致病菌，是社区医院感染的常见病菌，它能使虚弱的个体感染，并有获得抗多种抗生素的能力。NICU内的患儿通常为需要特殊护理的重症病人，常使用高效广谱抗生素，易使机体内的正常菌群受抑制或杀死，容易产生耐药性的细菌则大量繁殖，而频繁的护理操作与侵入性治疗中，无菌观念不强就可导致出现医院感染，甚至医院感染的爆发流行。
新生儿，尤其早产儿，机体各组织器官的形态和功能尚未成熟，对外界环境的适应能力、对疾病的抵抗力均较差，住院需要治疗及护理时间长，医务人员没有规范地进行手卫生而进行侵入性操作留置导管，或不合理长期使用抗生素等，极易造成细菌定植，院内感染机会增加。对新生儿留置导管细菌定植的分布、分离、鉴定、药敏等流行病学特点及定植菌发生医院感染的关系研究，可以提高医护人员卫生意识，为防治医院感染提供临床指导及病原学方面依据。
参考文献:
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2．刘健慧,王丹华.新生儿重症监护病房早产儿细菌定植的临床研究[J].中国实用儿科杂志，2006，21(1) ：41-44.）
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4.董叶丽，贾鸣，宗西明等.ICU医院获得性肺炎的调查研究[J] .中国感染控制杂志，2005，
4(2):173一175.

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