金黄色葡萄球菌临床分离株ermA、ermB、ermC及msrA基因检测分析.doc

金黄色葡萄球菌临床分离株ermA、ermB、ermC和msrA基因检测分析
吴青吴青1985 02，女，博士，主管技师，主要从事临床病原微生物耐药性研究 联系方式：15927651523 邮箱306823560@
，徐万洲，李艳 通讯作者：李艳，教授，博士生导师，yanlitf1120@
*（武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060）

摘 要：目的 分析金黄色葡萄球菌对红霉素、克林霉素耐药相关基因与耐药表型的关系，探讨其耐药机制。方法 对武汉大学人民医院检验科微生物室分离出了76株金黄色葡萄球菌进行革兰阳性球菌药敏组合试验，同时采用PCR方法检测ermA、ermB、ermC和msrA等耐药相关基因。结果 76株金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素耐药相关基因ermA、ermB、ermC阳性的有29株，msrA阳性的有2株。ermA、ermB、ermC和msrA检测与红霉素耐药表型的符合率为：82.9%；与克林霉素耐药表型的符合率为：89.5%。结论 本院金黄色葡萄球菌对红霉素、克林霉素耐药与其耐药基因相关ermA、ermB、ermC和msrA的编码相关。
关键词：金黄色葡萄球菌；红霉素；克林霉素；耐药基因
The frequency of the occurrence of genes ermA, ermB, ermC and msrA among Staphylococcus aureus strains
WU Qing，XU Wan-zhou，LI Yan* (Department of Clinical Laboratory，Renmin Hospital，Wuhan University，Wuhan 430060 China)

Objective Our aim was to understand the resistant characteristics of staphylococcus aureus and the relationship between erythromycin, clindamycin resistance phenotypes and its resistance mechanism. Methods 76 Saphylococcus aureus isolated from clinical specimens was identified and antimicrobial susceptibility tested by BD all-automatic microbiology analysis system. Using the D-test method to analyzed Erythromycin induced by clindamycin resistance. Genes (ermA、ermB、ermC and msrA) were detected by PCR methods. Results Gene ermA、ermB and ermC was found in 29 strains (38.2%). The msrA gene was present in the case of 2 strains (2.6%). Conclusions Clindamycin and erythromycin resistance of staphylococcus aureus is related to the encoding of gene ermA, ermB, ermC and msrA.
Keyword: Staphylococcus aureus; Erythromycin; Clindamycin； Resistance gene

金黄色葡萄球菌是临床上重要的致病菌，不仅是社区感染常见病原菌，也是医院感染的主要致病菌之一[1-2]。其致病力强，可以引起皮肤及软组织化脓性感染，还可引起肺炎、关节炎、骨髓炎、心内膜炎、菌血症和脑膜炎等严重感染[3]。大环内酯类抗菌药物是经常用于治疗葡萄球菌感染的药物，随着耐药菌株的增加使得该类药物敏感性大大降低。葡萄球菌对大环内酯类药物的耐药机制主要有靶位修饰和药物外排两种[4]。本研究通过对76例金黄色葡萄球菌红霉素、克林霉素耐药相关基因 (ermA、ermB、ermC、msrA) 的检测，分析金黄色葡萄球菌抗生素的耐药性和耐药基因的相关性，进一步了解金黄色葡萄球菌耐药产生机制。

1材料与方法
1.1 实验菌株 收集2013年1月-2014年1月本院住院及门诊患者送检标本中分离出的金黄色葡萄球菌76株（同一病人、同一部位分离的菌株只收1株进行试验）。菌株采用BD全自动细菌鉴定系统鉴定，收集的菌株以无菌干滤纸-80℃冻存，试验前转种于血琼脂平板复苏。金黄色葡萄球菌质控为ATCC25923、ATCC12228（均购于美国临床菌种保藏中心ATCC）。
1.2 培养基 血琼脂培养平板、巧克力琼脂培养平板、麦康凯琼脂平板、万古巧克力琼脂培养平板和药敏培养基（MH琼脂）均购自于广州迪景微生物公司。
1.3 药敏纸片和全自动鉴定板条 药敏纸片：红霉素（E）、克林霉素（DA）购自于OXIOD公司。BD全自动微生物分析仪生化鉴定板条和药敏板条购自德国BD公司。
1.4 金黄色葡萄球菌耐药基因引物设计及合成 PCR引物设计：引物根据在线软件primer3.0设计，并经NCBI-blast比对检测后生成。所有引物均由上海英维基生命技术有限公司（Invitrogen）合成，引物序列见表1：
表1 金黄色葡萄球菌耐药基因引物序列
耐药基因
引物序列
片段大小
ermA-F
5’-AGAAGCGGTAAACCCCTCTGAGA-3’
194bp
ermA-R
5’-CTTTTCGCAAATCCCTTCTCAACGA-3’
ermB-F
5’-ACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGCA-3’
263bp
ermB-R
5’-TGTCAGACGCACGGCTTTCA-3’
ermC-F
5’-GCTCAGGAAAAGGGCATTTTACCC-3’
59bp
ermC-R
5’-TGGCAGTTACGAAATTACACCTCTGT-3’
msrA-F
5’-CCATTTGACACCTTTGACGGCA-3’
367bp
msrA-R
5’-TCGGCTTTGTAAAATTGTGACGCT-3’

1.5 实验方法
1.5.1金黄色葡萄球菌红霉素、克林霉素耐药表型检测
采用BD全自动微生物分析仪进行鉴定，药敏检测采用药敏纸片扩散法(Kirby-Bauer法) 和最低抑菌浓度法 (MIC法)。红霉素诱导克林霉素耐药试验采用D-试验，克林霉素抑菌圈呈现D形为阳性。
1.5.2金黄色葡萄球菌ermA、ermB、ermC和msrA耐药基因检测
分离的金黄色葡萄球菌转种于血平板复苏后，挑取复苏后的单个菌落，加入到盛有500μL TE (pH 8.0) 的EP管中，涡旋混匀。100℃金属浴加热10min。自然冷却至室温，后经12000 rpm 4℃离心10min。离心后，取上清进行PCR检测。PCR反应体系：10 ×PCR mix 10μL，4pmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，加6μL双蒸水补足至20μL。退火温度为56℃。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，以溴化乙啶染色，用凝胶成像系统进行DNA片段大小分析。
1.6 统计学处理
采用世界卫生组织（WHO）推荐的WHONET4及5.6软件进行数据分析。

2 结果
PCR方法检测显示76例金黄色葡萄球菌中ermA、ermB、ermC和msrA基因检测的阳性例数为31例，检测阴性的例数为45例。对76株金黄色葡萄球菌进行革兰阳性球菌药敏组合试验显示金黄色葡萄球菌对红霉素耐药的有42株（耐药率为55.3%），对克林霉素耐药的有31株（耐药率为40.8%）。因此金黄色葡萄球菌对红霉素、克林霉素耐药表型与耐药基因型的符合率分别为82.9%、89.5%，见表2。

表2 ermA、ermB、ermC和msrA基因与红霉素、克林霉素耐药相关性
remA、ermC、ermC和msrA
红霉素
合计
克林霉素
合计
阳性
阴性
阳性
阴性
阳性
30
1
31
29
2
31
阴性
12
33
45
2
39
45
合计
42
34
76
31
45
76

3 讨论
近些年，随着大量广谱抗菌药物的应用，临床金黄色葡萄球菌分离株耐药菌株不断增多，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin - resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的感染率增加（2013年约60%），金黄色葡萄球菌对临床常用药物红霉素、克林霉素的耐药率也有所增加。本研究显示金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率已达55.3%，对克林霉素耐药的耐药率为40.8%。因此，了解耐药产生机制合理应用抗生素，避免滥用导致金黄色葡萄球菌感染的暴发流行，也易于临床更好治疗金黄色葡萄球菌感染[6]。
相关研究报告显示金黄色葡萄球菌对大环内酯类和林可霉素类抗生素耐药：一是抗生素作用靶位的改变，即由一类erm基因 (ermA、ermB、ermC) 编码的甲基化酶对细菌核糖体 (50S亚基23SrRNA) 进行特定核苷酸残基甲基化，此类作用靶位的药物与该靶位的结合能力下降，导致红霉素和克林霉素耐药。二是由msrA基因介导的主动外排机制。但哪种为主要的耐药机制，及所占的比率在不同的地区有差异。
本研究通过对本院住院患者临床标本中分离的76例金黄色葡萄球菌进行检测发现，ermA、ermB、ermC基因检测阳性有29例，而msrA检测阳性的仅有2例。说明本院就诊患者中金黄色葡萄球菌对大环内酯类和林可霉素类抗生素耐药主要由ermA、ermB、ermC基因编码甲基化酶导致药物与靶位的结合率下降所致；而由msrA基因介导的主动外排导致的耐药菌株数较少，是导致红霉素、克林霉素耐药的次要机制。同时我们发现，金黄色葡萄球菌对红霉素、克林霉素耐药表型与耐药基因型的符合率仅为82.9%、89.5%。因此还有其他耐药机制有待研究。

参考文献：
[1] Abdel-Haq N，Quezada M，Asmar BI. Retropharyngeal Abscess in Children：The Rising Incidence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus [J]. Pediatr Infect Dis J，2012，31 (7)：696-699.
[2] Sreeramoju P，Porbandarwalla NS，Arango J，et al. Recurrent skin and soft tissue infections due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus requiring operative debridement [J]. Am J Surg，2011，201 (2)：216-220.
[3] Liu C，Bayer A，Cosgrove SE，et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America for the Treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Infections in Adults and Children [J]. Clin Infect Dis，2011，52(3)：18-55.
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[5] 郝秀红，赵强元、李艳菌，et al. 2008年～2011年金黄色葡萄球菌的临床分布和耐药特征[J]. 现代检验医学杂志，2013，28(1)：132-133.
Hao Xiuhong，Zhao Qingyuan，Li yanjun，et al. Clinical distribution and drug resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics in 2008～2011[J]. Journal of modern laboratory medicine， 2013，28(1)：132-133.
[6] 吕媛，李耘，薛峰，et al. 卫生部全国细菌耐药监测网2011-2012年度血流感染细菌耐药监测报告 [J]. 中国临床药理学杂志，2014，30(3):278-288.
Lv Yuan，Li Yan，Xue Feng. Et al. Mohnarin report of 2011-2012: surveillance for resistance of bacteria cansing bloodstream infections[J]. China Journal clinical pharmacol，2014，30(3):278-288.