T载体-B载体与PCR克隆困扰.docx

T载体-B载体与PCR克隆困扰
盘古基因 李万波
PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。
一、T-载体与B-载体
PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-A Protruding）, 当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个其它碱基，比如“dTTP”。
PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4 DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会减少的。
上世纪80年代，拓扑异构酶1B的发现使得PCR产物的平端克隆技术（Blunt-end cloning vector, B-载体）取得了巨大改进。拓扑异构载体对平末端的连接速度和效率至今无可匹敌。这类载体有盘古基因的pACK4a系列、原核表达载体Topoied系列、哺乳类载体Topoied系列，此外还有Invitrogen和全式金的相应载体。该类载体由于Topoisomerase Ib的微弱的记忆功能，需要PCR引物的5’第一个碱基尽量与载体处理前切除的5’端碱基相同，这样才能获得近乎100%的克隆率。通常由于受PCR退火温度的限制，引物设计时5’-添加1个“A“碱基是较少影响引物的Tm值的。5’端添加G或C则会显著增加Tm。
上世纪与TOPO载体同时发展起来的还有“同源重组“克隆技术，由于其需要PCR引物的5’端附加较长的同源尾巴（与模板不配对的），一直不能被广泛接受，因为长达15个以上附加碱基的引物常常会使PCR困难（增加非特异性扩增的机会，分散了PCR酶精力，使主条带变弱）。但该技术在DNA序列拼接和点突变方面有其长处。
二、PCR酶
PCR酶就是DNA聚合酶（DNA Polymerase）。
PCR酶按其掺入错误几率来分，有高保真酶和Taq酶。
高保真酶的Error Rate在1/100万，即每聚合1百万个碱基时，可能出现1个掺入错误；而Taq酶的错配率在5/10万。
市场上的常见高保真酶种类很多：
有Pab、Pfu、Pwo、Kod等，以Pab的错配率最低（0.66 x 10-6）, 耐热程度最高（100℃煮沸5小时，还有80%活性）。
目前市场上的PCR酶按其组成成份来区分，可分为下列几种：
1、纯高保真酶： 扩增速度较慢，保真性最高，但扩增长度4-6kb；
2、纯Taq酶： 扩增速度较快，但峰值仅4kb左右；
3、嵌合分子PCR酶： 如NEB的Phusion，PangoGene的Paq等，这类PCR酶集保真性、速度、长度于一身，保真性强于Taq，扩增长度可达8～10kb。
4、混合PCR酶（Blend DNA Polymerase）：高保真酶由于3’→5’外切酶活性，“能进能退“，常常进3步退2步，所以，其总体聚合速度慢（30～60 bases/sec），但其具有修改错误的能力；Taq酶的聚合速度快（80～120 bases/sec）, 但”不细心“，常常拿错了碱基，一旦发生了掺入错误，她就会停下来等待，由于其没有3’→5’外切酶活性，所以，要么就”将错就错“掺入，要么就撒手逃跑，留下没有完成的残缺链。但如果与高保真酶配合，其高速度得以实现，Taq酶是长跑健将，高保真酶充当交通警察，两者合并，实现了高速度和长度的优势。
5、融合蛋白PCR酶：这类酶是PCR酶与DNA结合蛋白的基因融合的产物，融合的PCR酶可以是纯一酶，亦可以是嵌合酶。这类PCR酶的最大特点是---快！ 超快！！同时还提高了保真性。这类酶有fPab、fPfu、fKod、fK21、fPaq等高保真酶，也有frTaq、fcrTaq、fsdTaq、fcdTaq等Taq系列快酶和超快酶。
三、PCR酶带给克隆载体的困惑
很多国内PCR酶生产厂家（包括中外合资的试剂厂家）使用了混合酶，但并不注明，害怕失去竞争优势。但这些酶造成了实验者克隆试剂应用上的困惑。
混合酶中含高保真酶，其PCR产物两端的形状分为3类：
1）DNA链的两端均为平末端；
2）DNA链的两端均为A突出；
3）DNA链的一端是平末端，另一端是A突出。
以上3种产物的含量比例随保真酶与Taq酶的比例变化而变化。但是，你会发现这类PCR产物无论对T-载体还是B-载体都是部分匹配的，直接PCR产物克隆，连接效率会打折扣。
厂家如果不公开他的PCR酶特性，或者怕说明有A突出（好像有A突出就是保真性不高），生物科学家们如何判断呢？一般来说，纯高保真酶通常扩长是4～6kb，扩速是1-2分钟/kb; 纯Taq酶是扩长4～5kb, 扩速也是每kb 1～2分钟。如果不是融合酶或嵌合酶，要想扩长达到8～10kb或>10kb, 延伸速度在扩增2kb以上DNA片段时，<1分钟/kb, 它很可能就是混合PCR酶。
混合PCR酶产物直接克隆时，效率低于纯酶、融合酶和嵌合酶，这类酶的PCR产物在经过纯化后，抹平两端或加A后再与B-载体或T-载体连接，效果显著。
四、PCR产物胶回收后或离心柱纯化浓缩后，为什么克隆连接效率明显下降？
这个问题其实很简单，问题出在试剂与离心柱上。溶胶液(或DNA结合促进液)中含有“离液盐“，如盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠等是强力蛋白质变性剂，膜上会有微量残留；大部分离心柱底部的压膜环较厚（如QIAGEN），角砖头离心机条件下，微型离心柱底部侧方会有2～3微升的液体残留，造成离液盐残留，直接抑制连接酶和拓扑异构酶活性，使得克隆连接效率降低。
处理这个问题的一般方法是：离心柱洗脱下来的DNA产物再经过酚氯仿抽提1次，然后加乙酸钠和乙醇沉淀，最后溶于1 x TE或水，同样的产物，克隆连接效率会大为提高，这是因为PCR产物被精纯化的缘故。
这种去除杂质的纯化方法，适用于T-载体，同样适用于拓扑异构载体克隆连接， 也适用于双酶切重组连接。
综上所述，PCR混合酶提高了DNA扩增效率、速度和长度，但给克隆载体提供了隐存的问题。