猪附红细胞体病中药防治试验.doc

中药复方对猪附红细胞体病治疗效果观察
附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由附红细胞体(Eperythrozoon，简称附红体)寄生于人畜红细胞表面、血浆和骨髓而引起的一种人畜共患传染病，又称红皮病、黄疸性贫血、类边虫病、赤兽体病，临床上以发热、贫血、黄疸等为特征。1950年由Splitter首次发现猪附红细胞体病(Eperythrozoon Suis)，在我国，许耀成等(1982)首次在江苏南部红皮病猪血液中检查到猪附红细胞体(E.suis)。截止目前，已有30多个国家和地区报告了猪附红细胞体的感染情况。2000后我省许多地区相继出现该病，由于猪附红体病的传播广，而且能够影响红细胞的输氧功能和正常的血液免疫功能以及动物对疾病的抵抗能力，对养猪业造成很大经济损失，越来越引起畜牧兽医界、外贸检疫界的重视。
现在畜牧界对猪附红体病的治疗侧重于西药抗虫治疗。目前有很多报道，附红净、盐酸土霉素、红霉素、恩诺沙星、贝尼尔、磺胺对甲嘧啶和硫酸庆大霉素等药物治疗附红细胞体病都有一定的疗效但就是疗效不确定，时好时坏，且不能根除，治疗后有一定的复发。而对于中药治疗本病的报道甚少，袁园2008 年用中医辨证论治理论治疗了一例患附红细胞体病的儿童，结果表明中医辨证论治附红体病有较好的临床疗效， 且有推广应用价值。 今后如能开展中医中药治疗“附红体病”的临床与实验研究，对阐明中医中药的作用机理进一步提高中医药治疗“附红体病”的临床疗效。
现代医学研究认为，附红细胞体在血液中可改变红细胞膜的通透性,导致膜凹陷和空洞,易于溶解和破裂,使红细胞数减少,血红蛋白降低,还可导致机体贫血、黄疸、酸碱失衡等,被感染的红细胞携氧能力降低。由于红细胞也有免疫功能。因此,红细胞感染附红细胞体后,红细胞遭到破坏,使机体抵抗力下降而发生混合感染或继发感染。
中兽医理论认为：附红细胞体病属温热症,热势偏盛,是由感受外邪,燔灼气血所致,临床特征是发热、贫血、黄疽、红细胞自凝和红细胞的沉降率增加,缺乏血红蛋白。
基于以上认识，以清热解毒、凉血、清里、滋阴，利湿热等作用为原则进行组方对豫南地区发病猪进行治疗试验取得了一定疗效。
1 材料和方法
1.1 试验动物
试验动物为豫南地区部分猪场自然发病3天左右的具有贫血、黄疸、发热等明显症状的可疑附红细胞体病病猪。选择体重、性别、生长阶段相同确诊为附红细胞体病的病猪40头，供治疗试验。试验前血液经显微镜镜检初步确诊后,再经酶联免疫吸附试验确诊为患附红细胞体病猪。
1.2 药物组成及给药方法
组方1：青蒿20、骆驼篷子10 、川芎5、 丹皮10、栀子7.5、 土茯苓7.5g、铁齿苋5、蒲公英5 、鱼腥草5、 苦参5
组方2：青蒿15、茵陈20、大黄5、艾叶10、夏枯草10、叶下珠5、川芎5、丹参10柴胡5
方1，方2（所需中药饮片购自信阳市药材总公司）分别加水10倍量的水，浸泡0.5小时，煎煮1小时，重复一次,合并两次煎液，60度减压浓缩至每mL药液相当于0.5g原药材，10000转/每分离心。病猪每克体重给药1mL，拌料给药。
组方3：青蒿提取物（30:1）、骆驼篷子提取物（30:1）、川芎提取物（30:1）、土茯苓提取物（30：1）、栀子提取物(30:1)、蒲公英提取物(30:1)比例：4：1：2：2：2 做成10%的口服液。每头猪50公斤体重给药20ml,拌料给药。(购自西安金绿生物工程技术有限公司)
1.3动物分组和饲养管理
确诊为附红体病的猪40头分成3组，每组10头，隔离饲养，自由饮水。试验1组、试验2组、试验3组，分别用方1、方2、方3进行治疗。另选10生病猪，不予治疗。作为空白对照组。
1.4疗效评价指标
( l)死亡率。在试验期间，猪只出现附红细胞体病的典型症状并死亡，尸体剖检有典型特征性病变，血液压片阳性，血液推片姬姆萨氏和瑞氏染色检验，有附红细胞体存在。根据每组动物中的死亡数计算死亡率。(2)治愈率。在试验期问，猪只用药后体温、精神、食欲均恢复正常，不再出现体温升高、黄疽、贫血等临床症状，根据这些猪只的数量计算出治愈率。 (3) 感染率的变化：试验前所有猪测定感染率。在治疗的第3d以及停药后的第7d、12d采血测定感染率变化情况。（4）体温变化。
1.5血样采集与处理
患病组于用药前1天,用药后第1天、第4天、第7天分别自颈静脉采血,一部分常规分离血清,冰箱内保存,待测SOD、MDA。一部分全血，测定血液常规。对照组不用药,血样采集与患病组同步进行。
1.5.1 血常规测定
取血液样本，用全自动血液分析仪对血液进行测定。主要测定指标为：红细胞数目、血红蛋白。
1.5.2 SOD 活性测定
用黄嘌呤氧化酶法。试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作按说明书进行。
1.5.3MDA 含量测定
用硫代巴比妥酸法试剂盒购自南京建成生物工程研究所,具体操作按说明书进行。
1.5.4血清谷一丙转氨酶测定
按金氏直接显色法测定。
1.5.5用药前后红细胞附红细胞体感染率变化
空白对照照组、患病组用药前1天,用药后第7天分别自耳静脉采血、涂片、瑞氏染色、镜检(油镜,1 000×)20个视野,记录红细胞总数和感染附红细胞体的红细胞数,计算红细胞附
红细胞体感染率。
红细胞附红细胞体感染率(%)=(感染附红细胞体红细胞数/红细胞总数)×100
1.6据分析和处理　　
采用MicrosoftExcel软件单因素方差分析,并用LSD法作多重比较,所有数据以平均数±标准差表示
2结果与分析
2.1临床症状
大部分发病猪以体温升高，精神萎靡，黄疸，贫血等症状。仔猪感染发病后症状明显，常呈急性经过，发病率和死亡率较高。主要表现为皮肤黏膜苍白和黄疸

图2 病猪全身黄疸、红紫
图1 耳尖部出现紫红色斑块

2.2实验室诊断
经血液压片镜检观察球形、短杆形或星状的闪光小体，附着于红细胞表面单个或成团寄生，呈链状或鳞片状。严重感染病例的每个红细胞上附红细胞体可达20个以上，此时红细胞在光镜下犹如突起的蓖麻球和菠萝状(见图3)。附红细胞体在血浆中呈游离状，常做摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动，一旦附着在红细胞上以后则停止运动，运动中以个
体小者显得最活泼。高倍镜下（1000倍），姬姆萨染色后可见紫红色颗粒（图4），即为附红细胞体。瑞氏染色后细胞较大，红细胞和附红细胞体均为深蓝紫色，附红细胞体着色较深（见图5）。由图7可见，在星形红细胞的突出部位或红细胞表面，可见到圆形深染的颗粒状物，每个红细胞上有3-8个不等
图4姬姆萨染色附红细胞体(箭头所示)
图3 盐水压片附红细胞体形态

图5 瑞氏染色箭头所指为附红细胞体

2.3药物治疗效果
2.3.1体温变化
经药物治疗后各组动物的体温都发生了变化（见表2）。3个药物治疗组在用药3d后的体温下降都比较明显，基本恢复用到正常体温，相应的临床症状如贫血、黄疸、腹泻也基本恢复到正常；在第7d后精神状态、采食等完全恢复正常。

表1 各组动物诊疗过程中体温的变化
分组
体温的变化（℃）
用药前1d
1d
2d
3d
4d
7d
试验1组
41.6±0.4
41.0±0.4
39.5±0.5
38.9±0.5
38.6±0.4
38.5±0.4
试验2组
41.7±0.4
41.1±0.3
38.9±0.5
38.5±0.4
38.3±0.4
38.2±0.4
试验3组
41.7±0.5
41.1±0.4
38.9±0.4
38.6±0.4
38.5±0.3
38.5±0.3
空白对照
41.7±0.3
41.5±0.3
41.4±0.3
41.5±0.4
41.7±0.3
41.7±0.3
2.3.2药物治疗的治愈率的比较结果
空白对照组死亡率很高，只有一头存活，自愈率为10%。3个治疗组的治愈率明显升高，用药4d后，试验1组、试验2组、试验3组的治愈率分别为20%、10%、30%（见表2），与空白对照比较差异显著，试验3组治疗组治愈率最高。用药7天后，试验1组、试验2组、试验3组的治愈率分别为70%、70%、80%
表2各组动物治疗过程中的治疗效果的比较
分组
试验猪数（头）
治愈率（%）
1d
7d
试验1组
10
0
70
试验2组
10
0
70
试验3组
10
0
80
空白对照
10
0
10
2.3.3红细胞附红细胞体感染率检查结果
表2 各组动物治疗前后附红体感染率的变化
分组
试验猪数（头）
附红体感染率（%）
用药前1d
用药后4d
用药后7d
试验1组
10
74.9±4.9
4.2±3.1Aa
2.6±2.3Aa
试验2组
10
75.2±6.2
7.8±2.1Bb
2.6±0.7Aa
试验3组
10
74.6±5.9
3.4±2.1Aa
1.9±2.5Ab
空白对照
10
72.8±5.2
74.6±4.8
75.0±5.8
注：同一行/列两组数据比较，右肩标小写字母完全不同者差异显著(P<0. 05)，大写字母完全不同者差异极显著(P<0. 01)，无英文字母上标者，差异不显著(P>0. 05)。
空白对照组红细胞的附红细胞体感染率呈上升的趋势。药物治疗组的附红细胞体感染情况变化明显，用药4d后，4个治疗组动物的附红细胞体平均感染率分别由 74.9%、75.2%、74.6%降至4.2%、7.8%、3.4%；治疗后第7d降至 2.6%、2.6%、1.9%（见表2），与治疗前相比，虫体大大减少。
2.4 血液指标变化
2 .4.1. 血常规
2.4.1.1 各试验组猪血液红细胞个数变化
表3各组动物治疗后血液红细胞个数变化 （单位：万/mm2）
组别
用药前1d
用药后1d
用药后4d
用药后7
试验1组
382±6.35
371±1.32
431±1.64
500±3.11Aa
试验2组
358±6.71
368±2.13
442±1.77A
480±2.43Ab
试验3 组
364±7.66
365±2.11
401±2.33A
460±4.66Ab
空白对照组
320±3.56
370±2.21
350±3.45
330±8.74
空白对照组，猪患病后红细胞随发病日龄的延长，红细胞个数呈下降趋势；用药各组猪红细胞个数在第四天显著增加（P<0.01）,试验1组、2组、3组间差异不显著；在第7天，用药各组红细胞基本恢复到正常状态，试验1组比试验2组、3组差异显著（P<0.05）
2.4.1.2 试验组猪血液血红蛋白变化
结果见表4 。空白不治疗组，血液血红蛋白个呈下降趋势，各试验组血红蛋白在第四天呈逐渐恢复趋势、第7基本恢复到健康状态；用药各组间差异不显著（P>0.05）
表4各组动物治疗后血液血红蛋白变化（单位：g/%）
组别
用药前1d
用药后1d
用药后4d
用药后7
试验1组
6.12±0.25
6.23±0.21
8.14±0.67a
10.23±1.25A
试验2组
6.84±0.12
5.91±0.16
8.93±0.13a
11.25±2.14A
试验3 组
7.13±0.46
7.23±0.07
7.9±0.46b
12.34±3.12A
空白对照组
5.61±0.38
5.65±1.23
5.01±1.21
4.21±1.76
2.4.2 血液生化指标变化
2.4.2.1血清SOD活性变化
结果见5。血清SOD活性组内比较空白对照组在患病组用药前后SOD活性变化不显著(P>0. 05)；试验1组用药后第1天,SOD变化不多大(P>0. 05),用药后第4天SOD活性显著提高,与用药前比较差异显著(P<0. 05),用药后第7天SOD活性持续升高,与用药前比较差异极显著(P<0. 01)；试验1组、2组在用药前后SOD活性变化不显著。
表5验各组动物治疗后血清SOD活性变化（单位：活力单位/毫升（U/ ml）
组别
用药前1d
用药后1d
用药后4d
用药后7
试验1组
39.46±1.21
40.01±4.16
43.23±3.24a
47.25±3.34Aa
试验2组
37.87±1.11
37.92±3.23
42.97±1.33a
48.26±1.13Aa
试验3 组
38.69±1.34
41.11±1.11
43.33±2.12a
49.34±2.09Ab
空白对照组
41.34±2.15
40.25±2.17
38.47±2.35
36.13±3.03
2.4.2.3血清MDA含量变化
结果见表6。血清MDA含量组内比较:空白对照组在患病组用药前后血清MDA含量变化不显著(P>0.05)，第四天和第7天显著升高；试验1、2、3组能显著降低血清中的MDA含量。
表6试验各组动物治疗后血清中MDA变化（单位：n mol/ ml
组别
用药前1d
用药后1d
用药后4d
用药后7
试验1组
4.66±0.13
4.32±0.11
3.64±0.34A
3.23±0.16A
试验2组
4.34±0.24
4.01±0.18
3.83±0.25A
3.14±0.17A
试验3 组
3.89±0.04
3.77±0.23
3.57±0.14A
3.25±0.22A
空白对照组
4.89±0.11
5.12±2.34
6.76±0.07
7.44±0.21
2.4.2.4 血清中谷丙转氨酶变化
结果见表7空白不治疗组，猪血液中谷丙转氨酶呈上升趋势；各试验组谷丙转氨酶在第四天呈现逐渐恢复趋势，第7天基本恢复到健康状态；各试验组间差异不显著（P>0.05）
表7试验各组动物治疗后血清谷丙转氨酶变化（单位：mg/%）
组别
用药前1d
用药后1d
用药后4d
用药后7
试验1组
110±9.82A
88±1.34a
79±2.12A
69±1.43A
试验2组
96±5.79
102±2.31b
82±1.43A
73±2.13A
试验3 组
94±4.32
97±1.23a
88±1.3A
59±2.43A
空白对照组
91±1.23
90±1.45a
112±1.56
123±2.11
3 小结
华修国等报道,由于附红细胞体附着,使红细胞破裂增多,患附红细胞体病猪血红蛋白和红细胞总数均降低,导致机体出现贫血、黄疸、酸碱失衡等表现。本试验发现患病动物呈现黄疸、可识粘膜苍白和文献报道相吻合；血常规检测自然患病猪红细胞个数和血红蛋白含量随病程的发展呈下降趋势，各试验组中药治疗后红细胞个数和血红蛋白含量显著提高。
自由基在人与动物的疾病发生中起着重要作用,它通过脂质过氧化作用来攻击生物膜、损伤蛋白质和核酸,引起组织炎症、坏死和癌变等。正常机体内自由基的产生和清除保持着动态平衡,超氧化物歧化酶(SOD)是机体重要的抗氧化系统成员之一,能清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤,丙二醛(MDA)为自由基与不饱和脂肪酸反应形成的脂质过氧化物降解产物,检测SOD的活性和MDA的含量反映了机体清除自由基的能力及细胞受损的严重程度。一些实验证实,动物在感染寄生虫病后,其血清或组织中SOD、MDA均发生了显著的变化,说明氧自由基OFR)参与了这些疾病的发生发展过程。但猪患附红细 (Eperythrozoon)病后,其血清SOD和MDA有何变化尚未见报道
自由基与疾病之间因果关系的确立,大多是通过考察自由基清除剂对发病过程的影响而进行的。本实验中,患病不治疗猪血清SOD活性随病程延长呈下降趋势、MDA含量呈上升趋势。提示病猪机体代谢增强,活性氧自由基的生成量超过了清除量,进而引起SOD活性降低,最终使MDA含量升高；患病猪灌服中药后,血清SOD活性显著提高,MDA含量明显降低。由此得出自由基介入了猪附红细胞体病的致病过程。
血液中的自由基升高可能与组织缺氧、微循环障碍等有关。病猪临床上表现贫血症状，加上附红细胞体的附着,影响红细胞正常的O2和CO2交换,造成红细胞携氧能力降低,使组织细胞不能获得充足的氧气。大量的附红细胞体附着在红细胞表面,红细胞的变形性降低,以致难以通过微循环,造成毛细血管阻塞甚至血液外溢,形成瘀血点或斑。红细胞大量破坏释放出红细胞素,具有类似凝血因子Ⅲ和磷脂样物质的作用,可启动外凝血过程,同时红细胞破裂释放出的ADP又可加重血小板的聚集,促进DIC的发生。以上因素可能是引起病猪体内OFR含量升高的原因。
谷丙转氨酶升高表明动物发生了一定程度的肝功能损害。试验检测患病猪随病程的发展呈上升趋势这一结果说明了附红细胞体的侵入是综合作用于机体的，可引起溶血和其他组织器官的功能损伤；同时也提示我们在进行附红细胞体病的治疗时必须进行保肝利胆的支持疗法。
本试验治疗组所用药物主要以清热解毒、凉血、清里、滋阴，利湿热等作用为原则。所选药物中青蒿、叶下珠、柴胡、茵陈、艾叶、夏枯草等具有很好的清肝、利湿热、除黄疸作用；丹参、丹皮、有很好的凉血消斑、去热作用；骆驼篷子、蒲公英、土茯苓、鱼腥草有很好的清热解毒之功；川芎有很好的活血之用。研究表明，青蒿素和骆驼蓬子对附红细胞体在血液生长有很好的抑制作用。
通过给患病猪灌服中药后发现，用药第4天患病猪的血液生化指标有了明显改善，第7天基本恢复到健康状态。试验1组、2组、3组的治愈率分别为70%、70%、80%。试验3组治疗效果最佳。
组方选择：骆驼篷子产地西北运输不便；中药商品化提取物治疗效果显著，速度快
但成本过高；信阳地处大别山，药材资源丰富，茵陈、艾叶、青蒿、叶下珠、柴胡、丹参、蒲公英、土茯苓等野生药材产量价格便宜。组方2疗效显著、经济成本较低、取材方便易与在豫南地区推广。组方2值得进-步研究，如能做成注射剂、可解决使用不便问题，则更有利于推广