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纤维素柱填料的制备及其在
超氧化物歧化酶提纯中的应用
（武汉大学化学与分子科学学院，武汉 430072）
摘要：本实验采用由一种廉价易得的纤维素，通过溶解和搅拌，制得尺寸排阻色谱的填料，并由此种填料分离猪血中的超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，）,并采用邻苯三酚的自氧化来测酶的活性。
关键词：体积排阻色谱，梯度洗脱，纤维素填料，超氧化物歧化酶
0 引言
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，缩写为SOD，）,它广泛存在于各类生物体内。按其所含金属离子的不同分为3 种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。，它是一种重要的自由基清除剂，能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O2-而保护细胞，能治疗多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。在一系列萃取和离心后，过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化，得到较纯的SOD。
1 实验部分
1.1实验仪器与试剂
1．试剂
20%NaOH,SPAN-80，短线绒，4%硫酸，95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10m mol/L HCl, 邻苯三酚（用10mmol/L HCl 作溶剂配制，4℃下保存），新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液，三羟甲基氨基甲烷（Tris-）。
2.仪器
烧杯（250mL、500mL、50mL 各2 个，800mL 一个），量筒（50mL、
100mL）,1000mL 分液漏斗（1 个），药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各2个），玻璃搅拌棒，恒流泵（1），自动部分收集器（1），淋洗液瓶（2），电磁搅拌器（1），微量进样器（25μL）,玻璃色谱柱（1.5×20cm），试管100 支（5ml），台秤（2），机械水泵（1），真空干燥器（1），电炉（1），注射器及针头，回收瓶。紫外分光光度计（UV），荧光光度计，分析天平，低温高速离心机。
2 实验步骤
1. 纤维素柱填料的制备
①将14gNaOH,24g尿素溶于162g蒸馏水中配制7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液200ml；
②将上述溶液置于冰箱中冷冻至-12.3℃；
③将冷冻好的溶剂取出，加8.4g棉短绒浆，室温下快速机械搅拌几分钟，纤维素即完全溶解。将其置于冰箱中待用；
④准确称取3gSpan-80加入300ml的液体石蜡中，完全溶解后，加入到烧瓶中，以400r/min搅拌30min；
⑤用注射器向其中缓慢加入准备好的纤维素溶液100ml,在常温下乳化1h；
⑥在水浴环境下，升温至45℃保持2h；
⑦滴加10%的盐酸，酸化到pH值接近于7；
⑧停止搅拌，静置分层。回收上层石蜡，下层纤维素微球用蒸馏水和乙醇多次洗涤备用。
2.酶的制备
（1）取新鲜猪血500mL（已予先加入50mL 2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000rpm 离心20min 除去血浆，收集红细胞约250mL，加入等体积的0.9%NaCl 溶液，用玻璃棒搅拌充分洗涤，3000rpm 离心20min，弃去上清液（如此反复3 次），收集洗净的红细胞放入800mL 烧杯中，加250mL 重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min 以上，得溶血液500mL。
（2）往溶血液中缓慢加入在4℃下预冷过的95 0/0 的乙醇125mL（0、25 倍体积），
然后再缓缓加入在40C 下预冷过的氯仿75mL（0.15 倍体积），搅拌15min，室温下3000rpm 离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330mL（留样2mL 测酶活性），此即酶的粗提液。
（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O（按43gK2HPO4·3H2O/100mL 粗提取液的比
例），转移到分液漏斗，振荡后静置分层（约15min）。收集上层乙醇-氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500rpm）25min，弃去沉淀，得上清夜约150mL（留样1.5mL 测酶活性）。
（4）向上一步所得上清夜加入0.75 倍体积在4oC 下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD 便沉淀下来。室温下3500rpm 离心20min ,收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL 重蒸水中（呈悬浮状），在4℃下，在250mL 2.5m molL-1 pH7.6 的磷酸钾缓冲液中透析，每隔0.5h 换透析液一次，共换4-5 次。透析内液如出现沉淀，需在室温下3500 rpm 离心，弃去沉淀，收集上清液7mL（留样0.5mL）。
（5） 纤维素柱层析：将实验1 所得柱填料1#和2#按体积比1:1 混合并填充玻璃色谱柱，柱体1.5×20cm，填装时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密，均匀。装好后，填料的上部用一个带有小孔的聚四氟乙烯塑料圆片覆盖填料，以保持胶床顶
部平整，不受流入溶剂干扰。用2.5 m mol L-1pH7.6 的缓冲溶液作层析柱平衡液，用2.5mmolL-1(100mL)-200mmolL-1(100mL)pH7.6 的磷酸钾缓冲溶液进行梯度洗脱。流速为40mLh-1，每管收集4mL，收约20 管。以H2O 为参比，在280nm 处采用紫外吸收法测定
每管的吸光度，绘制淋洗曲线。参考的洗脱曲线见附录。 酶蛋白峰和酶活性峰重合。
3. 酶活性的测定
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：在试管中按表1 加入缓冲液，于25 oC 保温
20min，然后加入预热的邻苯三酚（对照管用10 mmo1/L HC1 代替），迅速摇匀倒入1cm比色皿中，在327nm 处，每隔断30s，测吸光度一次，通过改变邻苯三酚的用量控制自氧化速率在0.070A/min。

(2) SOD 或酶粗提取液的活性测定﹡：按表2 加样，测定方法同上。
单位体积活力（U/mL）＝｛［0.07-样液速率］/0.070/50%｝×100%×反应液
总体积×（样液稀释倍数/样液体积）
总活力（U）＝单位体积活力（U/mL）×原液总体积
﹡活力单位：在一定条件下，使每亳升反应液自氧化速度抑制50％的酶量定义为一个活力单位（（U）
2.实验数据
1.酶的最大吸收波长

图一.波长对吸光度作图

表一. 各峰对应的吸光度
由上面的数据可知，在12号峰，也就是在273nm的时候吸收波长最大。因此，在后面的测量中应采用这个波长来对淋洗曲线进行测绘。

2.淋洗曲线

由淋洗曲线可知，最高处在编号15的样品中，所以在后面的自氧化速率的测量中采用15号测量。

3.，酶的自氧化速率的测量
图三.不同体系的吸光度对时间作图
编号
体系
自氧化速率
单位体积活力（U/ml）

总活力U

1
邻苯三酚
9.93939*10-4
0
0
2
邻苯三酚+15号酶
9.27778*10-4
26958.6
107834.4
3
邻苯三酚+粗酶
4.99048*10-4
201653.1

4
邻苯三酚+淋洗前溶液
4.77143*10-4
210578.7

3.实验结果的讨论
1．在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。当红血球破裂溶血后，用氯仿-乙醇处理溶血液，使血红蛋白沉淀，而Cu.Zn-SOD 则留在水-乙醇均相溶液中。将磷酸氢二钾加入水-乙醇均相溶液中时，由于其极易溶于水，而在乙醇中的溶解度甚低，溶液明显分层，上层是具有Cu.Zn-SOD 的含水乙醇相，下层是溶有磷酸氢二钾的水相（比重大）。用分液漏斗分出上层具有SOD 的含水乙醇相，再加入有机溶剂丙酮，使SOD 沉淀。极性有机溶剂能导致蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。Cu.Zn-SOD的pI为4.95。将上一步收集的SOD 丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.6 的条件下，Cu.Zn-SOD 带负电，过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。
2.在本次试验中，由于开始时没有及时的除去血块，还有制备好样液后没有及时的测量紫外的数据，可能由此导致了经过DE-32 纤维素阴离子交换柱纯化后的酶活性并没有纯化之前的高。由此可知，SOD酶应该在合适的条件下，尽快测量，以期达到最准确的实验值。
3.在制备纤维素填料时，很多因素都对填料的具体性质产生很大的影响，比如我们通过探究在加热和不加热的条件下，制得的纤维素球的大小的比较，了解到在其他条件相同的情况下，加热可以促进纤维素球的长大。还有很多因素都对纤维素球的粒径产生影响，比如Span-80加入的量，纤维素溶液的浓度，石蜡油的纯度，搅拌的速度，乳化的温度等等。。。。
4.在开始时，由于邻苯三酚的浓度太高，所以在开始时无法体现酶的活性，在后来，将邻苯三酚的溶液稀释10倍后，才能体现酶的活性。
5.在本次试验中，提取过的酶由于放置的时间过长，或因温度过高而使其部分失活，而未纯化的酶一直放在冰箱中保持了一个适宜的环境，其活性依然保持了一个较高的值，所以其活性不如未纯化前的酶的活性。

4.结论
本次试验通过一系列手段，从猪血中提取了超氧化物歧化（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，），并通过自氧化测得了酶的活性。

致谢：
感谢周金平老师的悉心指导，感谢同组同学的合作帮助，感谢预备室老师为我们提供各种仪器和试剂。
参考文献

[1]武汉大学化学与分子科学学院实验中心.综合化学实验（第1版）[M].武汉：武汉大学出版社，2003，39-50。

Preparation and Purification of Superoxide Dismutase of
Cellulose Column Packing
( College of Chemistry and molecular sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, China )
Abstract:For the preparation of a lower-cost, highly distinguished  and goodph
sical performance of the new size exclusion chromatography, and by these paration and purification ofSOD.And then understand the protein precipitation of organic reagents, and gradient elution column chromatography. First，pure the 
SOD in pigblood , and then usePEG-2000 and cellulose cuprammonium solution blending method by column chromatography to classify  the enzyme. 
Keywords:SOD、cellulose wadding、sizeexclusion chromatography、gradient elution