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拟南芥psrp．3基因的PCR
扩增与生物信息学分析

拟南芥psrp．3基因的PCR扩增与生物信息学分析

[摘要] 采用PCR法获得拟南芥叶绿体核糖体psrp．3基因序列并进行生物信息学分析．根
据psrp．3基因序列保守区设计2对引物，通过RT-PCR获得预期大小的基因序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段．利用生物信息学软件对拟南芥psrp．3基因序列进行同源比对、氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、蛋白质功能及系统进化分析和预测．结果表明，RT-PCR获得了一段753 bp的序列，psrp一3蛋白是等电点为9．27的亲水性稳定蛋白，包含一个结构域和一个区域，a螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件，p折叠和伸展链散布其中，和菠菜、葡萄、蓖麻、大豆等的psrp．3蛋白有较高的同源性．为进一步了解psrp．3基因的功能和作用机制打下基础．
[关键词] 拟南芥；叶绿体；psrp一3基因
引言
叶绿体是植物细胞和真核藻类的重要细胞器，是植物进行光合作用的场所．叶绿体是半自主性细胞器，具有自身独立的遗传体系和蛋白质合成的全套机构，包括核糖体．叶绿体基因组是植物基因工程研究的热点u剖．至2006年底，已经公布了包括不同物种的叶绿体基因组数据82组，这其中包括同一个种的不同亚种∽J．研究发现，叶绿体70S核糖体含有58。62个核蛋白，其中约有2／3由核基因组编码，其余1／3由叶绿体基因组编码…1．虽然组成叶绿体的绝大多数蛋白质都是来自细胞质，但目前在各种植物的叶绿体中已确定了20个电子传递和光合固碳的基因：编码RuBP羧化酶的大亚基，Ps I的2个亚基，PsⅡ的8个亚基，ATP合成酶的6个亚基，细胞色素b／f复合物的3个亚基，这些都是叶绿体核糖体所合成的重要蛋白质∞剖．因而，研究叶绿体核糖体的重要基因，不仅可以在分子水平上阐明蛋白质之间的相互作用、光合作用各过程的调控，而且可以了解叶绿体的起源与进化、核质互作关系．在叶绿体核糖体中存在着6个特殊的蛋白质(质体特异性核糖体蛋白，plastid．specific ribosomalpro．teins，psrps)，它们都是由核基因编码．其中，psrp—l，psrp-2，psrp．3，psrp-4位于30S小亚基上，psrp-5，psrp-6位于50S大亚基上b4J．叶绿体核糖体只负责合成叶绿体DNA编码的不到一百个多肽，但是其中却包括一些在生物圈中含量最丰富的蛋白质．因而，叶绿体核糖体必须能够维持一个比较高的蛋白质合成率，并且必须具备响应光强度的变化而改变蛋白质合成速率的机制．为了满足光合成蛋白质的需要和核糖体功能的协调，在长期的进化过程中，叶绿体转录翻译发展了大量叶绿体特异的调控元件．定位于核糖体的psrps，就是这样的一套调控元件．psrps可能以总体的形式参与叶绿体中蛋白质合成调控，但目前作用机制并不清楚．
Psrp-3基因在拟南芥存在两个同源基因，分别位于染色体I和染色体V(ATlG68590，AT5G15760)上．ATlG68590可以表达，AT5G15760不转录，有可能是伪基因或沉默基因，只在特殊条件下才会表达怕J．psrp．3基因所编码的psrp．3蛋白存在两种形式，一种是N．末端经过翻译后修饰，一种未修饰．这两种形式之间的比率是否固定目前尚不清楚，很可能依据光照强度和光照时间的改变而变化【3,6]．psrp．3蛋白质参与光介导的叶绿体蛋白合成，但其在光介导蛋白合成中的具体功能及作用机制，迄今尚无研究报道．
1材料与方法
1．1材料
1．1．1植物材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana
ecotype Columbia)Columbia生态型(col一0)．培养条件：光照强度I>3 000 Ix，光暗周期为12 h／12 h，温度为(25±1)℃，相对湿度约70％．生物信息学分析以NCBI数据库中的拟南芥psrp-3基因(ATl G68590)作为研究对象．
1．1．2茵株和质粒
大肠杆菌JMl09、质粒pBIl21载体由南京中医药大学第--I临i床学院针药结合实验室保存．
1．1．3试剂及工具酶TaqDNA聚合酶、反转录酶、dNTP、OligadT等购自宝生物工程(大连)有限公司和上海生工生物公司，DNA分子Marker、DNA回收试剂盒、琼脂糖等其他相关生化试剂购于上海生工生物公司．引物由大连宝生物公司合成．
1．2方法
1．2．1拟南芥总RNA提取
用Tfizol试剂法提取叶片总RNA：将0．3 g叶片放在180℃热处理过的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，然后将粉末放入装有l mLTrizol试剂的Eppendorf管中．用宝生物公司提供的RNAiso Reagent试剂盒提取总RNA，经琼脂糖电泳检测总RNA质量．
1．2．2引物设计与psrp-3基因的RT．PcR扩增反应
根据GenBank已登录的拟南芥psrp．3基因序列(ATlG68590)，设计合成引物【10]．并根据植物双元载体pBIl21的多克隆酶切位点，分别设计2条含有Sac I和XbaI限制性内切酶位点的PCR引物．上游引物R：5’．CGTCCA7唧AGACAcAAAA7rCTCCA田GT形硼盼3’，下游引物L：5 7．A’rCGAGAGCTCAA CI’cAGAGTrGCI'IGATG'IqqB3’．以拟南芥RNA为模板，R和L为引物，进行RT-PCR扩增．在PCR管中加入总RNA 8皿，Oligo dT 2皿置于70℃5 min，然后放于冰上；再依次加入5 x Buffer 4 gL，10 mmol／L dNTP 2ttL，AMV
l汕，RNase Inhibitor 1肚，42℃放置60 min，冰上冷却，产物置于70℃保存．50μL PCR反应体系为：Ex-Taq25μL，cDNA2μL，引物R和L各1μL，去离子水补至50μL．反应条件为：预变性94℃，2 rain；循环参数，94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，1 min 30 s；循环数35；最后延伸，72℃，5 min；4℃保存．PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下割取含有目的片段的凝胶，由试剂盒回收PCR产物，将回收的片段与pBll21载体连接，转化大肠杆菌JMl09，通过菌落PCR方法筛选重组子，提取阳性克隆的质粒DNA，由大连宝生物公司完成测序．
1．2．3蛋白序列同源性分析和系统进化树构建
利用NCBI数据库中的Blot软件将目的基因编码的氨基酸序列与GenBank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索，获得玉米、葡萄、大麦、蓖麻、水稻、拟南芥和大豆等物种的序列数据和信息．进而利用ClustXl．83软件进行多序列同源性比对和聚类分析【13-14]．聚类分析包含以下20个物种的序列：蓖麻(Ricinus communi8(castor bean)，XP-0025291 30)、毛果杨(Populus trichocarpa，XP-IX)23 15948)、葡萄(Vitisvinifem，CAN68341)、菠菜(Spinacia oleracea，P82412)、大豆(Glycine lI瞰，ACUl4369)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，ACJ86010)、北美云杉(Picea sitchensis，ABK26571)、玉米(zea mays，NP-001148519)、水稻(Ormsativa，NP-001052994)、高梁(Sorghum bicolor，XP-002446621)、醉蝶花(Cleome spinosa，ABD96848)、小立碗藓(Physcomitrella patens subsp．patens，XP．001778658)、大麦(Hordeum vulgare，048609)、绿球藻(Chlorokybus atmophytieus，m001019068)、紫红紫菜(Porphyra purpurea，NP-053961)、条斑紫菜(Porphyra yezoensis，YP-537032)、蓝细菌(Synechococcus sp．CC9902，m376514)、囊泡藻(Vauchefia litorea，ⅥL002327484)和赤潮异弯藻(Heterosigtm akashiwo，YP-001936340)．进化树使用MEGA4软件的邻接归并法(NJ法)构建，Kimum两
参数模型(Kimura 2-parameter)，自展检验(bootstrap analysis)重复l 000次．
2结果
2．1拟南芥psrp．3基因的PCR扩增及鉴定
提取的总RNA纯度高(见图1)，通过琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明RNA有略微降解，28sRNA的亮度与18sRNA亮度相若．以提取的总RNA反转录的cDNA为摸板，用psrp．3基因的特异引物对cDNA进行PCR扩增，扩增产物经l％琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图2)，得到的扩增条带为约750 bp的单一条带，与目的片段大小相同．所得产物回收后，将该片段连接到pBll21载体上，转化大肠杆菌JMl09，得到重组质粒，委托大连宝生物公司实验室测序，所得结果用BLAST软件在生物信息学数据库中进行搜索，发现和NCBI数据库中的拟
南芥psrp一3基因(ATlG68590)序列完全一致，说明所扩增的条带为psrp．3基因cDNA克隆．
2．2 psrp-3蛋白的基本理化性质分析
对基因序列及其氨基酸羊列进行分析发现，psrp．3基因cDNA全长753 bo，有1个开放阅读框(核苷酸59～556)，编码l条166个氨基酸残基的蛋白质，由l条44个氨基酸的转运肽和121个氨基酸的成熟蛋白组成．对所推测氨基酸序列进行分析表明，该蛋白相对分子质量为18 472．4，等电点为9．27，负电荷残基(Asp+Gh)总数为13，正电荷残基(Arg+Lys)总数为17，分子式为C,832H1333N2170‰&，原子总数为2 632，不稳定系数为38．35，该蛋白分类为稳定蛋白．脂肪系数为89．28，亲水性评估为一0．212，依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可见该蛋白为亲水性蛋白．该蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Ser(18个，占10．8％)，含量比较少的氨基酸是Tyr(1个，占0．6％)．相较于藻类和光合细菌psrp．3，拟南芥成熟psrp．3有1个延长的N．末端和1个截断的c．末端．
2．3系统发育分析
我们将玉米、大麦、水稻、拟南芥、葡萄、苜蓿、菠菜、蓖麻、毛果杨、云杉和大豆等20个物种的psrp．3序列集合到一起，进行多重序列比对，根据psrp一3序列揭示的遗传分化
距离，采用邻接法构建并绘制了系统进化树．分析表明，供试物种的psrp．3序列具有非常高的同源性，这种高同源度在保守的功能结构区域——YcF65更为明显．从构建的进化树可以看出，供试的20个物种的psrp．3被聚成两个大类．囊泡藻和赤潮异湾藻的psrp。3聚为一类．拟南芥、物种的荔雪善p萄、srp要3羹然裟翼蓁舅兰霎，：矗 一聚为另一类．水生植物绿球藻聚为一支，而陆生的拟南芥、蓖麻、葡萄等高等植物和低等植物小立碗藓聚为另一支．其中，拟南芥、蓖麻、毛果杨、葡萄、菠菜、大豆和蒺藜苜蓿等双子叶植物的psrp一3聚为一分支：蓖麻和毛果杨聚成一组，豆科的大豆和蒺藜苜蓿聚成一组；而水稻、高粱、大麦和玉米等单子叶植物的psrp一3聚为另一分支．
3讨论
随着DNA序列研究的广泛开展，对植物叶绿体基因组的研究发现，其具有下列特性：叶绿体DNA呈单亲遗传，极少(或没有)发生重组，极少或没有种内变异，且不受基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的进化路线，不依赖于其他任何数据即可构建分子系统树、查明植物的进化历史．因而对叶绿体的重要基因进行分析，可从进化和系统发育上，揭示物种亲缘关系和阐述生物遗传多样性，并已有大量关于利用细胞器DNA或基因来进行遗传与进化的研究和报道．psrp．3位于核糖体30S小亚基上，不与rRNA连接，是一个进化上保守的叶绿体核糖体蛋白，YCF65(ycf65基因产物)是它在光合蓝细菌中的同源蛋白i6-9j．psrp．3被认为做为调控因子参与叶绿体蛋白质合成的光调控，但作用机制目前尚不清楚b驯．本文对拟南芥叶绿体基因组中的psrp．3基因进行了PCR扩增和生物信息学分析．用BLAST对psrp-3进行同源性分析显示，psrp-3同源基因产物在非光合的真核生物基因组及古细菌基因组中不存在，而在光合细菌及高等植物的基因组中存在，并且psrp．3蛋白的同源性在高等植物中高(7l％～83％)，而与藻类及光合细菌的同源性低(36％～56％)．这种高同源度在保守的功能结构区域——YcF65，更为明显．发现该区域氨基酸水平上的同源性较高，说明叶绿体基因组具·有高度的保守性，可以为物种系统学与遗传多样性的研究提供有用的信息．
利用psrp．3氨基酸序列，对物种进行聚类分析能够较好地反映物种间亲缘关系的远近，结果显示。拟南芥、蓖麻、毛果杨、葡萄、菠菜、大豆和蒺藜苜蓿聚成一类，说明它们具有相近的细胞质起源．除低等植物小立碗藓和北美云杉划分为一个子分支与植物学分类结果不符外，其余均与植物学分类的结果一致，这可能与该基因中遗传密码子的变异有关，暗示仅以氨基酸序列为指标研究植物系统关系的结果并不确切，应该与传统植物学分类的结果相对应．单、双子叶植物各成一支，分化明显，这表明在psrp．3蛋白的亲缘关系上，可以按照单子叶植物和双子叶植物进行划分．豆科的大豆和蒺藜苜蓿被聚成一组，紫红紫菜和条斑紫菜被聚成一组，从进化的角度上讲，这是显而易见的事．本研究表明，利用芦巾．3蛋白构
建的系统进化树，较准确的表明了20个物种之间的系统发育关系，因而利用叶绿体核糖体psrp基因来作为遗传与进化研究的参考是可行的．
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