多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案.docx

多花木蓝盐胁迫的生理响应试验方案
材料和样品：多花木兰种子、NaCl、完全培养液（硝酸钙1克、磷酸二氢钾0.25克、硫酸镁0.25克、氯化铁0.25克、氯化钾或硝酸钾0.25克）、蒸馏水。
溶液培养皿设置：设置5组不同培养条件，选择饱满、均匀、外观良好的种子，放入溶液培养皿中，每皿30粒，分别加入相同量的完全培养液及6ml不同浓度的NaCl溶液（浓度梯度：0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、12 g/L），编号1、2、3、4、5，第1组为对照组，实验中每组设3个重复试验。
将培养皿置于温室中培养，每天下午3时适当补充蒸发水分，以维持盐分浓度的稳定。培养相同时长，待多花木蓝长出幼苗后，分别测定5组多花木蓝幼苗的各项指标。

一、多花木蓝幼苗生长特性指标测定
生长指标测定：记录每组植株成活数量，计算成活率；用直尺和游标卡尺测量株高、茎粗、最大侧根长。
根系活力的测定：TTC法
材料、设备仪器及试剂
（一）材料：水培的多花木蓝根系。
（二）仪器设备：分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；电子顶载天平（感量0.1g）；温箱；研钵；三角瓶50ml； 漏斗；量筒100ml；吸量管10ml；刻度试管10ml；试管架；容量瓶10ml；药勺；石英砂适量；烧杯10ml、1000ml。
（三）试剂：1）乙酸乙酯（分析纯）；2）次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；3）1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100ml，用时稀释至各需要的浓度；4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7）。5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；6）0.4mol·L-1琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。
三、实验步骤
（1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）称取5组根尖样品各0.5g，每组取三次，分别编号11、12、13，21、22、23，31、32、33，41、42、43，51、52、53，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做5个空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。
（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲腙。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
四氮唑还原强度（mg.g-1根鲜重h-1）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）
叶绿素含量测定：分光光度法
材料、仪器设备及试剂
（一）材料：新鲜的多花木蓝叶片。
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。
（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜多花木蓝叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取5组剪碎的新鲜样品各0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：
Ca=13.95A665－6.88A649
Cb=24.96A649－7.32A665
据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

二、多花木蓝幼苗生理指标测定
超氧化物歧化酶SOD测定：氮蓝四唑(NBT)比色法
材料、仪器设备及试剂
（一）材料：多花木蓝幼苗的叶片
（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂　1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
实验步骤
1. 酶液提取　取一定部位的多花木蓝叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应　取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各溶液
试剂（酶）
用量/ml
终浓度（比色时）
0.05mol/L 磷酸缓冲液
1.5

130mmol/L Met溶液
0.3
13mmol/L
750μmol/L NBT溶液
0.3
75μmol/L
100μmol/L EDTA－Na2液
0.3
10μmol/L
20μmol/L 核黄素
0.3
2.0μmol/L
酶液
0.05
2支对照管以缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.25

总体积
3.0

混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算　至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
式中：Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液总体积（ml）Vt为测定时样品用量（ml），W为样品鲜重（g），蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
丙二醛(MDA)含量测定:硫代巴比妥酸法
材料、仪器设备及试剂
1．实验材料：多花木蓝幼苗的叶片
2.仪器：分光光度计，研钵，剪刀，恒温水浴，试管20 mL×4， 离心机。
3.试剂：5 %三氯醋酸；0.5 %硫代巴比妥酸（用5 %三氯醋酸溶解定容）；
0.05 mol · L–1磷酸缓冲液pH 7.8。
实验步骤
　　1．取小麦植株上不同叶位的叶片3~5片，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段，混匀。
2．称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和2 mL 0.05 mol · L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用3 mL 0.05 mol · L-1磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。
3．在提取液中加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀。
4．将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。
5．待试管内溶液冷却后，3000×g离心15 min，取上清液并量其体积。以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm和450 nm处的消光值。。
　　3．计算含量

式中，Vt：提取液总体积（mL）；Vs：测定用提取液体积（ml）；FW：样品鲜重（g）。
叶绿素含量测定:丙酮比色法

叶片细胞电导率：将叶片样本在蒸馏水中浸泡8-10小时，再用电导率仪测定。
材料、仪器设备及试剂
（一）材料：小麦、女贞叶片;
（二）仪器设备：1）电导仪；2）天平；3）温箱；4）真空干燥器；5）抽气机；6）恒温水浴锅；7）注射器。
（三）试剂：NaCl溶液
实验步骤
1）制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测定，可读出电导度。
2）选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。
3）一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。
4）放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。
5）将抽过气的小玻杯取出，放在实验桌上静置20min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在20～25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。
6）测过电导率的之后，再，放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。
比较不同处理（萎蔫处理与对照）的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。
伤害率=处理电导率/煮沸电导率

可溶性糖含量:80%乙醇提取后用蒽酮比色法测定
器材与试剂
1. 实验仪器 分光光度计，恒温水浴，电子天平，烘箱，刻度试管，漏斗
2. 实验试剂 活性炭，乙醇
葡萄糖标准液：称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100 mg，用80%乙醇配制成1000 ml溶液，即得每ml含糖为100 μg的标准液
蒽酮试剂：称取1 g 蒽酮，溶解于1000 ml稀硫酸（将760 ml相对密度为1.84的浓硫酸用蒸馏水稀释成1000 ml）溶液中，置于棕色瓶中，当日配置使用。
3. 实验材料 植物叶片或种子
实验步骤
1. 可溶性糖的提取
植物叶片或种子在110℃烘箱烘15 min，然后调至70℃过夜。干叶片磨碎后称取50 mg样品倒入10 ml刻度离心管内加入4 ml 80%乙醇，置于80℃水浴中不断搅拌40 min，离心，收集上清液，其残渣加2 ml 80%乙醇重复提2次，合并上清液。在上清液中加10 mg活性炭，80℃脱色30 min，80%乙醇定容至10 ml，过滤后取滤液测定。
2. 绘制标准曲线
取20 ml带塞试管，编号，按下表配置系列浓度的标准葡萄糖溶液。然后在每只试管中加入5 ml蒽酮试剂，混匀，盖上塞子，在沸水浴中煮沸10 min（水浴重沸后计时），取出，立即用水冷却至室温，在625nm波长下，分别测量各管的光密度值，用0号管调零。以光密度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

管 号 0 1 2 3 4 5 6
葡萄糖标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
80%乙醇（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0
葡萄糖含量（μg） 0 10 20 40 60 80 100
3. 测定
吸取上述糖提取液1 ml，加入5 ml蒽酮试剂混合，用上述同样的方法，在625 nm处测得OD值，以0号管调零。由标准曲线查得提取液中的糖含量，然后根据每ml提取液含有5 mg干样品中的糖，再行计算样品中含糖百分数。

过氧化物酶(POD)活性测定:以愈创木酚作底物,721型可见分光光度计在720nm下测吸光值
实验材料：不同浓度Cd处理7d的菱叶片；
试剂：0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）愈创木酚；H2O2。
实验步骤
1.提取酶液：叶片2片（wgFW）+pH7.0磷酸缓冲液5mL，研磨，离心（4000rpm*10min），上清液即为粗酶液。
2、配制反应：1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)。一般临用前配制，冰箱内短期保存。
3.酶反应：3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数，之后每10S读数一次，至OD值>1.000
计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算；
以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
酶活力=活力单位(U)/ w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)/V总

游离脯氨酸(Proline)含量测定:茚三酮比色法
一、原理
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12. 滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。

三、多花木蓝幼苗光合特性指标测定
净光合速率测定：光合仪（红外线CO2分析仪）测定CO2的吸收（氧电极法测定氧气的释放）
气孔导度测定