中药化学成分提取分离和结构鉴定.doc

中药化学成分提取、分离常用方法

中药化学成分鉴定和结构研究简介

第一节 提取、分离常用方法
v 中药化学的研究必须从复杂的植物组成成分中提取、分离出单纯成分即单体化合物，才能更好地加以研究和利用，所以提取、分离是中药研究的起点，亦是这一学科的重要任务之一。

一、各种提取方法
v 中药成分的提取常用一些经典方法：
1、溶剂法
2、水蒸汽蒸馏法
3、升华法
（一）、溶剂提取法
1、溶剂提取法的原理
常见溶剂的表达式：
v C6H6…………………..苯
v CHCl3…………………氯仿
v Et2O…………………...乙醚
v EtOAC…………………醋酸乙酯
v MeOH…………………甲醇
v EtOH…………………...乙醇
v Me2CO ………………..丙酮
v n-BuOH……………….正丁醇

v 水
v 有机溶剂

v 常用的提取溶剂
l 水：水是一种强极性溶剂，主要用于提取亲水性成分—无机盐、糖类、小分子多糖、鞣质、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐以及苷类等。

l 酸水：提取生物碱及碱性物质。
l 碱水：提取酸性物质—有机酸、蒽醌、黄酮、内酯、香豆素以及其它酚酸类成分。
l 优点；安全，来源广，便宜。
l 缺点:提取物复杂,易霉变,难以过滤。

v 亲水性有机溶剂：甲醇、乙醇，丙酮三者与水混溶。
l 乙醇常用，即可提取水溶性成分，又可提取脂溶性成分。

l 优点；提取时间短，效率高、杂质少，不易霉变。毒性小、来源较方便，价格便宜，可回收使用。（沸点约70℃左右）
l 缺点；易燃，安全性差。

v 亲脂性有机溶剂：
l 常见有石油醚、苯、氯仿、乙醚、醋酸乙酯等。
l 只能提取极性小的脂溶性成分，难以提取水溶性成分。

l 特点：大多沸点低，易于挥发，易燃；多数有一定毒性；价格较贵，因此对设备要求较高，注意安全。
l 这些溶剂对植物组织穿透性较弱，故提取时间较长。

v 溶剂提取过程
l 加溶剂于药材中（需适当粉碎）—扩散—渗透—溶解—达到细胞内外溶液浓度动态平衡—滤出—添加新溶剂

v 影响提取的因素
l 药材的粉碎度
l 温度
l 浓度差
l 时间
l 药材的干湿程度
2、常用的提取方法
1）浸渍法
l 不需加热；浸出率低。
2）渗漉法
l 不需加热；溶剂量大，时间长。

3）煎煮法
l 水作为溶剂。加热，提取液难过滤，提取物易发霉。
4）回流提取法
l 加热提取；效率高
5）连续回流提取法
l 加热提取，效率高，溶剂省。

（二）水蒸气蒸馏法
v 原理；根据分压定律，当挥发性成分与水共同加热时，整个系统的蒸汽压应为各组份蒸汽压之和。即 P=P水+PA
v 适用于能随水蒸汽蒸馏而不被破坏的中药成分。

（三）升华法
l 固体物质受热不经液态而直接气化，蒸汽遇冷又冷凝成原来的固体的过程
l 樟木中樟脑
l 茶叶中的咖啡因

二、中药化学成分的分离方法
（一）系统溶剂分离法
v 溶剂由低极性到高极性依次分别提取中药中化学成分的方法。
v 根据“相似相溶的原则”

（二）结晶和重结晶法：
v 利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法
1、结晶的条件：
l 浓度：需要结晶的溶液达到过饱和状态
l 温度：最适温度为5－10oC

2、溶剂的选择
v 所选择的结晶溶剂；
l 对所需成分热时溶解度大，冷时则小；
l 对杂质热时不溶或热、冷时均易溶。

3、重结晶
l 重结晶是指多次重复结晶。重结晶的溶剂一般可参照结晶的溶剂，但也经常改变。
4、操作过程：

（三）两相溶剂萃取法：
v 利用被分离组分中各成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而达到分离的方法。

（四）沉淀法：
1、乙醇沉淀法：
v 水提醇沉法
l 水提液 浓缩 加醇 沉淀 过滤 滤液

v 醇提水沉法
l 醇提液 浓缩 加水 沉淀 过滤 滤液

2、酸碱颠倒法：
v 酸性成分 加碱 碱液 酸化 沉淀

v 碱性成分 加酸 酸液 碱化 沉淀

l 适合于酸性和碱性成分的分离

3、铅盐沉淀法
v 中性醋酸铅：能沉淀有机酸、蛋白质、氨基酸、粘液质、鞣质、酸性皂苷、酚类成分
v 碱式醋酸铅：除上述成分外，还能沉淀中性皂苷、黄酮苷、糖类等
v 脱铅：Pb++ + H2S PbS

（五）透析法：
（六）分馏法

（七）色谱法 (Chromatography)
v 柱色谱
（Column Chromatography、CC)
v 薄层色谱
（Thin Lager Chromatography、TLC)
v 纸色谱
(Paper Chromatography、PC)

v 薄层色谱
Ø 薄层色谱是近20年来发展较的一种微量快速的分离技术。
Ø 薄层色谱是将吸附剂涂布在玻璃及其它板材上，形成一薄层进行色谱的色谱法。

v 纸色谱 (Paper Chromatography)
Ø 使用专门的色谱用纸进行色谱的色谱法。

一）  操作步骤：
1．点样：
2． 展开：
3． 显色：
4．比移值（Rf值）的计算

Rf值=

1、吸附色谱 (absorption chromatogaphy)
v 利用吸附剂对被分离成分吸附能力的差异进行分离；
v 常用吸附剂－硅胶、氧化铝和活性炭；聚酰胺

聚酰胺色谱原理

v 溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱到强依次顺序：

水<甲醇或乙醇(浓度由低至高)
<丙酮<稀氢氧化钠水溶液或氢氧化铵<甲酰胺<二甲酰胺<脲素水溶液

v 聚酰胺仅对含酚羟基的化合物产生吸附力。
v 聚酰胺与这类化合物产生的吸附力的强弱与其所含酚羟基的数目和位置有关。

2、分配色谱(partition chromatogaphy)
v 利用被分离组分在二相互不相溶的溶剂中的分配系数的不同得以分离的方法。
v 柱色谱
（高压液相色谱、气相色谱）

Ø 高压液相色谱:液-液分配
固定相－液体
流动相－液体
Ø 正相色谱与反相色谱

Ø 气相色谱：液－气分配
固定相－液体
流动相－气体

v 纸色谱 (Paper Chromatography)
Ø 属分配色谱
Ø 低的纤维为支持剂，使用专门的色谱用纸。
Ø 水为固定相
Ø 流动相常用 正丁醇：醋酸：水
［BAW］ （4：1：1）上层。

3、排阻色谱 (exclusionchromatogaphy)
又称为分子筛过滤、凝胶过滤法
v 利用被分离组分分子量的大小不同进行分离。
v 常用葡萄糖凝胶(Sephadex)、羟丙葡萄糖凝胶(Sephadex LH-20)。

4、离子交换色谱
(Ion-exchange chromatography)
v 利用被分离成分对离子交换亲和力的不同进行分离；
Ø 离子交换树脂为固定相,
Ø 用水或与水混合的溶剂作为流动相。

v 离子交换树脂分为两大类：
强酸型 SO3-H+
1.阳离子交换树脂
弱酸型 COO-H+

强碱型 N+(CH3)3·X-
2.阴离子交换树脂
弱碱型 N+HR2·X-

v 阳离子交换：
R-SO3-H+ + Na+Cl- R-SO3-Na+ + H+Cl-
v 阴离子交换：
R-N+(CH3)3OH-+ Na+Cl-
R-N+(CH3)3Cl-+Na+OH-
v R=聚苯乙烯树脂
R-SO3-H+ + B+ R-SO3-B+ + H+
v B=Base

v 离子交换法的先决条件:被分离物质首先应具备离子状态。
v 分离生物碱用强酸性阳离子交换树脂
v 分离酸性成分有强碱性阴离子交换树脂
第二节 成分鉴定和结构研究简介
前言
化合物的纯度测定和判断
结构研究的主要程序
结构测定常用光谱分析
紫外光谱 红外光谱
质谱 核磁共振谱

v 无论是理,工,农,医学和药物学等学术界还是业务界,任何一个部门,在使用有机化合物时,都需知道原料,产物,副产物,代谢物,分解产物(成分),添加物和杂质等各种有机化合物的结构.

v 我们是进行药物学研究的,对药物成分结构的了解尤为重要。
v 中药经提取、分离得到单体化合物后，必需进行结构鉴定。才可能为药理、临床、结构改造和新药设计研究提供可靠的依据。因此，结构研究、鉴定工作是中药化学的重要内容之一。

v 结构鉴定经典方法:
通过颜色反应，元素分析，化学降解和合成等资料数据加以系统地综合完成这项工作。

v 例如吗啡（morphine）1803年鸦片中分离得到纯品，1847年确定分子式，1881年从其锌粉蒸馏物中得到菲，也仅仅捕捉到有关吗啡结构的影子，直到1925年在大量工作的基础上，Gulland和Rlbinson才有可能提出吗啡的结构式。

v 第二次世界大战结束以后，有机化合物的结构测定经历了巨大的变化，这归功于科学家将物理学的成就应用于化学的结果经典的化学方法己让位于谱学分析。这就是实验室较常用的“四谱”。

v 紫外
(Ultra-violet Absorption Spectrometry UV)
v 红外
(Infrared Absorption Spectroscopy IR)
v 质谱
(Mass Spectrometry MS)
v 核磁共振
(Nuclear Megnetic Resonance Spectroscopy NMR).
一、化合物的纯度测定和判断
v 结晶型化合物
l 晶形、色泽一致
l 熔点明显和熔距（1～2oC)
v 液体化合物
l 沸点恒定、沸距应1oC左右

l 薄层检查：三种展开条件均一个斑点（Rf值：0.3-0.7)
l 气相色谱
l 高压液相色谱
l 均显示一个峰。

结构研究的主要程序
(一)
1．注意观察样品在提取、分离过程中的现象。
2．测定有关理化性质，如不同pH、不同溶剂中的溶解度及色谱行为、灼烧试验、化学定性反应等。
3.结合文献调研。

(二)
1．分子式测定可采用下列某种方法：
v 元素定量分析＋分子量测定；
v 高分辨质谱（HR－MS）
v 计算不饱和度

不饱和度的计算:
C3H4O2

(三)
1．官能团定性及定量分析。
2．测定并解析化合物的有关光谱，如UV、IR、MS、1HNMR及13CNMR。
3. 结合文献调研。

(四)
1．综合分析光谱解析及官能团定性、定量分析结果。
2．与己知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、衍生物制备或人工合成）。
3. 进行文献调研。

(五)
1．测定CD或ORD谱。
2．测定NOE谱或2D－NMR谱。
3．进行X－线衍射分析。
4. 进行人工合成

紫外光谱
v 分子吸收紫外-可见光区200-800nm（纳米）的电磁波而产生的吸收光谱称紫外可见吸收光谱简称紫外光谱。
v 紫外光谱图是吸收的波长或频率对吸收强度（吸光度A或摩尔吸收系数ε）作图所得吸收曲线。

一．基本原理
v 当可见光或紫外线照射在分子上时，电子就从基态向能量升高的激发态跃迁。此时，吸收相当于激发能波长的光。其吸收频率决定于分子的能级差，计算式为

v 电子跃迁具有σ-σ*，n-σ*,π-π*,n-π*等形式。然而，一般所用分光光度计由于波长在200纳米（nm）以上的区域内，故只能观察到跃迁能量小的π－π*和n－π*的吸收带，吸收光谱将出现在紫外区域（200－400nm）。

v 实际上紫外光谱法的应用主要限于共轭体系，但不能表达整个分子结构情况。因此，相同的化合物应有相同的紫外光谱图。相同的紫外光谱图并不一定相同的化合物。

v 因此，对于分子中含有共轭双键、α，β－不饱和羰基（醛、酮、酸、酯）的结构的化合物以及芳香化合物的结构鉴定来说紫外是一种较重要的手段。常常用于推断化合物的骨架类型；

二、紫外谱图提供的结构信息
v 现作以下归纳：
1．化合物在200－800nm内无紫外吸收，说明该化合物是脂肪烃、脂环烃或它的简单衍生物（氯化物、醇、醚、羧酸等）、甚至可能是非共轭烯。

2．220－250nm内显示强的吸收（近10000或更大），这表明共轭体系吸收带的存在，即存在共轭的两个不饱和键（共轭二烯或α，β－不饱和醛、酮）。
3．250－290nm内显示中等强度吸收，且常显示不同程度的精细结构，说明苯环的存在。

4．250－350nm内显示中、低强度的吸收，说明羰基或共轭羰基的存在。
5．300nm以上的高强度吸收，说明该化合物具有较大的共轭体系。若主强度吸收具有明显的精细结构，说明稠环芳烃、稠环杂芳烃或其衍生物的存在。

三、结构式的确定
例1．从一中药中分离得到的一萜类化合物甲，可能为A和B二种异构体之一，试用紫外光谱进行确证。

经测定其紫外吸收光谱，有三个吸收峰，分别为211nm(4.1)、240nm(3.5)、和314nm(2.7)。

四、在药物结构鉴定上的应用
v 用紫外吸收光谱对物质鉴定时，主要根据光谱上的一些特征吸收，包括最大吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比等。

v 两个化合物若相同，其吸收光谱应完全一致。相同紫外光谱但不一定为相同化合物。
v 在鉴定时，试样和标准品以相同溶配制成相同浓度，分别测定吸收光谱，比较光谱图是否一致，如果没有标准品，也可以和现成的标准光谱图相比较
红外光谱
v 当一束红外光照射物质时，被照射物质的分子将吸收一部分相应的光能,转变为分子的振动和转动能量，使分子固有的振动和转动跃迁到较高的能级，光谱上即出现吸收谱带，称红外吸收光谱。

v 通常以波数(cm-1)为横座标，吸收度（A）或百分透过率为纵座标作图得吸收曲线。

v 分子振动与红外吸收频率：
由原子质量和组成的双原子分子，其振动频率可由方程表示；
其中C为光速，f 为力常数

Ø 例如：单键．双键．叁键共振动频率分别为
Ø 700－1500cm-1,
Ø 1600-1800cm-1
Ø 2000-2500cm-1；
Ø O－H键的伸缩振动在3600cm-1,而O－D键则降至2630cm-1，
3.基团振动
以次甲基（-CH2-）振动为例：

v 特征区：(functional group region)
l 4000-1500cm-1
v 指纹区:(finger print region)
l 1500－650cm-1

v 特征区吸收峰受分子其它部分结构影响较小，且有规律，谱带较疏，易于辨认。
v 指纹区：吸收峰谱带较密集，图谱复杂。由于分子结构的微小差异，会引起谱带的不同，尤如人的指纹一样，所以可用于化合物的鉴别。
红外解析：
1．红外吸收波数
v 红外谱图波数可分为以下六个区,结合最常见的基团讨论如下：
⑴．4000－2500cm-1
v 这是X－H（X包括C、N、O、S等）伸缩振动区。

①．羟基（醇和酚的羟基）：
v 游离羟基吸收在较高波数，峰形尖锐；
v 缔合羟基吸收在较低波数，峰形宽而钝；
v KBr晶体含有微量水时，在3300cm-1附近出现吸收峰。

②．胺基：
v 胺基的红外吸收与羟基相类似。
v 游离胺基在3300－3500cm-1范围，缔合者降低100cm-1。
v 伯胺有两个吸收峰，易于与羟基相区别。
v 仲胺只有一个吸收峰，且尖锐。
v 叔胺在此区域无吸收。

③．烃基：
v C-H键振动的分界线是3000cm-1。
v 不饱和碳-氢伸缩振动频率大于 3000cm-1
v 饱和碳－氢伸缩振动频率小于3000cm-1。

⑵ 2500－2000cm-1
v 是叁键和累积双键等的伸缩振动区。
⑶2000-1500cm-1是双键的伸缩振动区，这是红外谱图中最重要的区域。
v νC=O 1650－1900cm-1，峰尖或稍宽，强度大，一般为图中最强峰或次强峰。

v νC=C :1600－1670cm-1, 强度中等或较低
v νC6H6 :1450，1500，1580，1600cm-1, 杂芳环和苯环相似吸收。

⑷．1500－1300cm-1
v 该区域主要提供了C－H弯曲振动的信息。
v νCH3 ~1380,~1460cm-1同时有吸收。前一峰分叉示有偕二甲基的存在。
v νCH2 ~1470cm-1

⑸．1300－910cm-1
v 所有单键的伸缩振动频率，分子骨架振动频率都在这个区域。
⑹．910cm-1以下
v 苯环因取代而产生的吸收（900－650cm-1）, 是判断苯环取代位置的主要依据。
v 烯的碳－氢弯曲振动频率处于本区及前一区（1300－900cm-1）
红外光谱在结构鉴定当中的应用
v 用于己知化合物的鉴定。
l 样品图谱和标准品在同样条件下测定红外光谱，若两个样品的光谱图完全重合，则可判断它们为同一化合物。

v 未知化合物结构鉴定：一般只能提供其所含主要功能基的信息，要鉴定结构还要和其它光谱综合分析。

质谱
v 质谱是记录分析样品在质谱仪中经高温（300oC）气化，气态分子受一定能量冲击，失去电子后生成带正电的阳离子，在稳定的磁场中按质荷比（m/z）顺序进行分离，通过检测器记录而得到质谱图。图谱中每个峰代表一个质量数。

v 质谱提供结构信息
l 分子量
l 分子式
l 分子的裂解方式和碎片离子提供整个分子的结构信息。

v 电子轰击质谱(EI-MS)
（Electron impact ionization Mess)
v 化学电离质谱（CI）
(Chemical ionization Mess)
v 场解析电离（FD）
(Field Dosorption Ionization Mess)
v 快速原子轰击电离质谱
(Fast Atom Bombardment Mess)

1．简单开裂

Ø 2．麦氏重排

Ø 3．逆狄尔斯-阿耳德开裂（retro Diels Alder fragmentation, RDA）

Ø 4．醇类脱水重排

Ø 5．其它开裂

Ø 在鉴定有机化合物时，可与标准图对照，进行检索，核定该化合物是否为己知物，如为未知物，可按下列程序进行解析。
1)确定分子离子峰，并注意分子离子峰对基峰的相对强度比，以判断分子离子的稳定性。

2)确定分子式，即利用同位素峰的丰度比确定有否含硫、氯、溴等元素及确定分子式。
3)高分辨质谱测定分子式。计算出未知物的不饱和度。

氢核磁共振谱
v 有机化合物是碳氢化合物，1HNMR可提供分子中氢原子所处的化学环境，各官能团或分子“骨架”上氢原子的相对数目，以及分子构型等有关信息。

核磁共振光谱是以共振峰频率（常以表δ示）对峰的强度作图而得。

常见的偶合常数：

核的Overhauser效应（NOE效应）：
v 在分子内有立体空间位置上接近的两个核组质子时，如果用双照射法有选择地照射一个或同一核质子使其饱和，则另一个或一同核组质子的信号强度就会增加，这一现象被称为核Overhauser效应。

v NOE主要用来确定两种质子在分子立体空间结构中是否距离相近，若存在NOE，则表示两者接近，NOE值越大，则两者在空间的距离就越近。实际工作中，用NOE常常可以判断谱线中信号的归属，是确定分子中某些基团的位置，立体构型和优势构象的重要手段之一。

1HNMR解析步骤：
v 观察峰的位置（化学位移值）
v 观察峰的大小（积分曲线）
v 观察峰的形状（裂峰、峰数）
v 和其它光谱综合解析
v 必要时可查阅标准NMR图谱比较。
1HNMR
13CNMR谱
v 由于FT－NMR仪器的应用，测定13CNMR己逐渐谱及。有机化合物为碳骨架的化合物，因此13CNMR谱己成为有机天然产物结构测定中最重要的工具之一。
v 13CNMR化学位移范围为0-250ppm，
比1HNMR谱的0-10ppm要大得多。
13CNMR

v 碳谱中，两个同位碳（13C）相连的机率很小，只有0.1%，可以忽略13C－13C同核偶合的影响，但1H和13C的偶合影响（异核偶合）却很突出。1H核自旋偶合干扰产生的裂分数目符合N＋1规律。

五．13CNMR测定方法
1．质子去偶法（porton decoupling method），也叫噪音去偶法。测定噪音去偶谱时，所用去偶器的频率覆盖了全部持子的共振频率，故使所有1H对13C核的偶合影响全部消除，每个不等价的碳原子（碳核）在图谱上均表现为一个单峰。

2.偏共振去偶谱
v 为噪音去偶法的补充，偏共振去偶谱则将去偶器的频率设定在比作为内标准的四甲基硅（TMS）信号（0ppm）高出1个ppm处进行照射，并测定13CNMR。这时测得的13C核信号由于连结1H核的数目不同而产生不同的分裂，符合（N＋1）效应。

3. DEPT谱
v DEPT法是一种常用的测试方法。在DEPT法中，通过改变照射1H的第三脉冲宽度（θ），使作45℃、90℃、135℃变化并测定其13CNMR谱。由这些图谱的加减，可以分别得到CH、CH2和CH3的图谱。

v θ为45℃时，CH、CH2和CH3均显正峰；
v θ为90℃时，仅得到CH的正峰
v θ为135℃时，CH2为负峰，CH、CH3为正峰；
v 季碳在DEPT谱中不出现峰

六．13C谱的解析
1．进行13CNMR测定
v 先测定质子噪音去偶13C谱。必要时再作偏共振或全偶合谱，有时可进一步进行选择去偶。现多做 DEPT谱。分析碳原子的属性。

2.标出各谱峰的化学位移
v 可以把测出的谱线分为四个区；
①烷碳区，在高场0－50ppm。包括直链烷碳和环烷碳。
②取代烷碳区，50－80 ppm。包括与氧、氮、等相连接的烷碳，与氧相连的位于较低场，与氮、硫相连的次之。

③芳、烯区，100－150ppm。
• 1H谱很容易区分芳氢与烯氢，而13CNMR，芳碳与烯碳在同一区域。
• 烯碳成对地出现。

v 苯环则根据取代基的不同，取代位置及对称性，可能出现二条谱线（对位），三条谱线（邻位对称取代），四条谱线（单取代或间位对称取代），六条谱线）（不对称取代）。

④羰基及叠烯区。150－200ppm 或更低场。酮的羰基或叠烯的中间大风大碳在最低场，酸、酯、酰氯等在较高场。

3.检查所判断的结构式
v 首先检查结构式与样品的IR、MS等是否符合。必要时，合成对照化合物，对比检查，以最后确定化合物结构。

二维相关谱(2D-NMR)
v 八十年代以来，在核磁共振软件开发和应用最新进展中，二维核磁共振谱技术，似乎对增强化学家确定复杂化合物结构的能力提供了最大的潜力。二维谱是将ＮＭＲ提供的信息用二维座标系绘制成的图谱。