游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法).doc

八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)
本方法适合饮料中游离色氨酸的测定
本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。
（一） 方法提要
试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。
（二） 仪器
1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。
2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。
3. 天平（精确到0.0001g）。
4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。
（三）试剂
1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。
2. 甲醇（色谱纯）。
3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。
4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。
5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。
（四）测定步骤
1. 样品处理：
①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。
②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。
2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样分析，以测得的色氨酸的峰面积，分别对色氨酸的浓度绘制标准曲线。
3．色谱条件
①色谱柱：Ultimate C18液相色谱柱 4.6mm i.d.× 150mm, 5µm。
②流动相：甲醇＋0.1%磷酸溶液=18+82（V+V）。
③流速：1mL/min。
④柱温：35℃。
⑤紫外检测波长：280nm。
4. 样品测定：取样品滤液10μL进液相色谱分离测定，根据色谱峰保留时间定性，外标峰面积法进行定量。

标准色谱图
（五） 结果计算
根据待测样品色谱峰面积，由标准回归方程式中得样液中游离色氨酸含量，计算出样品中的含量。
试样中游离色氨酸含量按下式进行计算。
X=
式中：
X——试样中游离色氨酸含量，单位为毫克每一百克（mg/100g）；
c ——样液的浓度，单位为微克每毫升（µg/ mL）；
计算结果保留三位有效数字。
（六） 注释
1. 色氨酸的化学名称为L-2-氨基-3(β-吲哚)丙酸，分子式为C11H12N2O2。它为白色或微黄色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦。在水中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中不溶，在甲酸中易溶，在氢氧化钠试液或稀盐酸中溶解。色氨酸是一种必需氨基酸，它的作用主要有两个，即防止烟酸缺乏症和增加血清素水平。在所有氨基酸中，色氨酸被认为是特定食品中含量最少的。虽然稀少，色氨酸是非常必要的，因为它会由肝脏转换成维生素B3（烟酸和烟酰胺），这有助于防止烟酸缺乏症。色氨酸的作用还包括负责神经传递素的生产。色氨酸作为一种血清素的初期形式，这种神经传递素负责控制睡眠模式，食欲和情绪。
2. 文中试剂如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。
参考文献
[1] 邓自西. 高效液相色谱-二极管阵列检测法测定酵母浸膏中水解和游离色氨酸的含量[J] .浙江农业学报，2003, 15(05)：310-313.

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