疟原虫的镜检技术制片染色.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,疟原虫的镜检技术制片染色,疟原虫的镜检技术制片染色,第1页,主讲内容,厚薄血膜制作与染色。,疟原虫计数方法。,疟原虫的镜检技术制片染色,第2页,血膜制作（所需设备）,载玻片：,新玻片,浸入有液态洗涤剂清水中,10-20,分钟，洁净棉巾逐一擦拭，再用清水冲洗洁净，晾干，最终用洁净柔软棉巾将玻片擦亮。,已用过玻片,浸泡于洗涤剂溶液中,1-2,天，或浸泡于煮沸,5%,肥皂水中,1-2,小时，再放入新配置洗涤剂溶液中,1-2,小时，逐一擦去血膜痕迹，清水漂洗洁净，擦亮。,采血针：一次性,玻片盒：预防污染和昆虫吸食血膜,75%,酒精棉球：采血前后消毒,记号笔：玻片上书写号码,疟原虫的镜检技术制片染色,第3页,血膜制作（取血时间）,现症病人和流调普查时可不考虑取血时机。但在诊疗或需要某期疟原虫作标本时，则应掌握适宜取血时机。,疟疾经典临床表现分前驱期、发冷（寒战）期、发烧期、出汗期和间歇期五期。,间日疟在前驱期相当于肝内期疟原虫发育，因原虫密度太低，镜检多为阴性。发冷（寒战）期相当于红内期成熟裂殖体涨破红细胞期，镜检多为裂殖体和环状体。,发烧期，,外周血中以,环状体（小滋养体）为主，,也可见到,裂殖体；,出汗期因原虫密度太低，镜检多为阴性。,发作后数小时,，间歇期外周血中以,大滋养体,为主，形态较易辩认，为诊疗有利时机；发作,36-48h,，可检出裂殖体；发作,1-2,次后，,配子体,出现较多。,恶性疟较理想取血时间是在发作后至,20h,内取血，,发作后,2,小时左右，,此时环状体发育至最高峰，初发患者退热后常查不到原虫。末梢血血检到恶性疟原虫配子体，是在末梢血出现环状体之后,7-10,天。,疟原虫的镜检技术制片染色,第4页,血膜制作（取血操作）,在采集标本、制作血片前，首先要查对患者,姓名、年纪和住址,。,疟原虫的镜检技术制片染色,第5页,取血部位和方法,耳垂或无名指（婴幼儿拇趾或足跟）,，,通常在耳垂取血，先用,75%,酒精棉球消毒取血部位，待,酒精干后,，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针快速刺入皮肤，不宜过深或过浅（,1,2mm,为宜）。然后用左手大拇指、食指和右手中指协同轻轻挤压出血滴。,疟原虫的镜检技术制片染色,第6页,用于检验疟原虫血涂片有两种：,一个是将血液涂成薄膜状，称,薄血膜,；一个是血液涂成圆盘状，称,厚血膜,。,最好一张玻片上同时制作厚、薄两种血膜。,疟原虫的镜检技术制片染色,第7页,涂制厚、薄血膜位置,作为标本血片每张玻片涂厚、薄血膜各,1,个。方法是将载片分为,6,等分，第,1,、,2,格备贴标签及编号用；厚血膜涂在第,3,格中央，薄血膜涂在第,4,格前缘至第,6,格中部。,门诊和发烧病人血片每片,1,人，涂,2,个厚血膜,1,个薄血膜，以防血膜脱落而影响检验。,标本片,发烧病人血片,标签,疟原虫的镜检技术制片染色,第8页,厚血膜制作,取洁净载玻片,1,张，左手持载玻片平置,右手持推片，,用推片一角，从取血部位刮取,约,4,5,微升,血量,（相当于火柴头大小,），,使血滴与平置载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，,转,2,4,圈,，涂成,直径,0.8,1cm,大小圆形厚血膜,。,位置，,位于玻片,右,1/3,处,（中央偏右或,6,等份中与贴标签,1,、,2,份相邻第,3,份中部）。,外观，,圆形厚薄均匀，边缘整齐,。,过厚易于脱落，过薄达不到检出率要求，以,1,个油镜视野,5-10,个白细胞为宜,。,疟原虫的镜检技术制片染色,第9页,薄血膜制作,用推片一端边缘中点从取血部位,刮取约,1,1.5,微升,血量,（相当于,1/4,火柴头大小），使血滴与平置载玻片中线接触，,并形成,25,35,0,夹角,，待血液向两侧扩展约,2cm,2.5cm,宽,时,，均匀而快速地从右向左推成舌状薄血膜（约,2.5cm,长）。,注意：,推制时速度要均匀，血滴大小、推片与载玻片之间夹角大小及展开血膜速度快慢等常影响血膜厚薄。,也可载玻片平置在桌面上操作。,位置，,位于玻片左半个别或第,4,格前缘到第,6,格中部,；,外观，,舌状厚薄均匀，无划痕,；,应在玻片上形成平铺红细胞，红细胞之间相互接触而不相互重合。,疟原虫的镜检技术制片染色,第10页,正确推片姿势,疟原虫的镜检技术制片染色,第11页,标准疟疾厚薄血膜位置,疟原虫的镜检技术制片染色,第12页,血膜编号,血膜制成后，马上在玻片面上贴标签或写上受检者号码，以防差错；待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上血片种类代号和受检者个人编号，依次次序插入标本盒内。,疟原虫的镜检技术制片染色,第13页,制作血膜注意事项,清洗玻片，且勿碰撞、磨损,载玻片必须完全清洁无油渍或污垢。制片时，手指勿接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。作为推片玻片边缘一定要平滑，才能使推出血膜均匀一致。,刚涂制血膜要平放在标本盒内,厚血膜未干前勿使标本盒倾斜，以免血膜倾向一侧，造成血膜厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检验结果；晾干血膜时应注意防尘，预防苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸血膜；干后应及时装入标本盒并盖严。,血膜应自然干燥,切忌在毒太阳下晒或火烤，加紧其干燥可采取手背上或衣服摩擦、风吹，干透后才能用甲醇固定薄血膜。,夏天标本尽可能,24-48h,内固定染色；冬天也不能超出,72h,。,放置时间越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及时染色，薄血膜宜先用甲醇固定（,1,3,分钟）然后用过滤清水对厚血膜溶血，晾干后装入盒内盖严，待以后染色。,疟原虫的镜检技术制片染色,第14页,染液种类,疟原虫染色，当前临床上应用最广泛是,瑞氏（,Wright stain,）和姬氏染液（,Giemsa stain,）。,这些染液中主要染剂都包含美蓝、伊红和由美蓝氧化所成天青，所以称,多色性染剂,。,咱们主要用,姬氏染液,，它含有方便，染色效果稳定，便于长久保留优点。瑞氏染色，染色时间短，但染色效果不如姬氏稳定，主要在门诊量大门诊试验室使用。,疟原虫的镜检技术制片染色,第15页,染液染色原理,是染料与被染物阴阳离子相互吸附而结合一个化学反应。,红、白细胞和疟原虫所含蛋白质氨基酸电离出阴阳离子与酸碱染料伊红、美蓝有色集团所带阴阳离子相互结合便被染上不一样颜色。,疟原虫和白细胞,胞浆,被染成,蓝色，,红细胞、疟原虫和白细胞,核,被染成,紫红色。,红、白细胞和疟原虫蛋白质均由氨基酸组成，每个氨基酸电离出一个带正电荷,-NH,3,+,和一个带负电荷,-COO,-,。多色染剂,碱性染料美蓝,有色基团带阳离子，可与细胞中带负电荷,-COO,-,个别结合，使之成为,蓝色,。,疟原虫,、淋巴和大单核细胞,胞浆,、嗜碱性白细胞颗粒等酸性蛋白质，故,被染成蓝色,。,酸性染料伊红,有色基团带阴离子，可与细胞中带正电荷,-NH,2,+,个别结合，使之呈,红色,；但美蓝与伊红都不能使疟原虫和白细胞核着色，可美蓝氧化后产生,天青有媒染作用，,于是，在媒染物与染料共同作用下，,疟原虫,和白细胞,核,被染成,紫红色,。,疟原虫的镜检技术制片染色,第16页,注意,：蛋白质和氨基酸都是两性电解质，要求,染液,pH,值,7.0-7.2,很好。,染液偏酸,时，所带正电荷增加，易于伊红结合，使,红细胞和疟原虫核染成鲜红色,，而,淋巴细胞和原虫胞浆着色较差,；反之，当,染液偏碱,时，,红细胞和嗜伊红白细胞颗粒等被染成紫蓝色,，不易观察。,疟原虫的镜检技术制片染色,第17页,姬氏染液母液配置方法,材料：,1,、姬氏粉,5,克,2,、甘油,250ml 3,、甲醇,250ml,将姬氏粉置于研钵中，加入少许甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入,500ml,有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少许甲醇，洗掉剩下个别，倒入瓶中，再次加甲醇洗后倒入瓶中，至洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置于,55,60,水浴中或温箱内,24h,或室温内,3,5,天，天天用力摇动,5,分钟，即成原液。配制,1-2,周后能够使用。姬氏染液是当前较优良血膜染剂，能长久保留而不变质。,注意事项：,1.,高纯度,试剂。,2.,所用器皿,绝对无水,（伊红在水溶液内碰到美蓝或天青即可相互结合而产生沉淀，从而失去染色力）。,3.,边加边磨，充分研磨,；整个染色液配制时间不能少于,5,个小时。,疟原虫的镜检技术制片染色,第18页,姬氏染液染色方法,血片干燥后,先用,甲醇或无水酒精固定薄血膜（瑞氏不需固定）,再用,清水对厚血膜溶脱血红蛋白,(,新制作也可直接染色,),，然后再进行染色。,注意,：,吸收母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物泛起影响染色效果。,成批血片染色,：,将已用甲醇固定薄血膜血片插入染色缸，倒入,3%,姬氏染液稀释液（,3,毫升姬氏原液加缓冲液或蒸馏水,97,毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色,30-40min,（依据当地实际情况，酌情增减染色时间），然后用清水轻轻将染液漂洗洁净，将血片标本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。,单张血片染色,：将处理好血膜，加姬氏母液,2-3,滴,，加,缓冲液,或蒸馏水,1ml,，混合均匀，染色,15-20,分钟,左右，然后用清水轻轻将片上染液冲洗洁净，晾干镜检。,（勿直接倾倒掉玻片上染液，预防渣滓附着在玻片上冲不掉影响镜检,）,较理想染色结果是,红细胞为淡红或淡紫红色,，,疟原虫胞质呈蓝色,，,核为紫红色,，,疟色素为棕褐色,。,疟原虫的镜检技术制片染色,第19页,快染,配制,8-10%,染液,(,每张血片约需染液,2ml):,量筒内量,2ml,缓冲液或新鲜凉开水，直接滴加姬氏原液,4-5,滴，混匀，滴入待染标本厚薄血膜上，染色,10-15min,，清水细缓冲洗，晾干镜检,。,慢染,配制,3%,染液,:,在染色量筒内量,2ml,蒸馏水或新鲜凉开水，再滴加姬氏原液,2,滴，混匀，滴入待染标本上，染色,3040min,。清水细缓冲洗，晾干镜检。,姬氏染液浓度,门诊染色,疟原虫的镜检技术制片染色,第20页,血片制作染色评定考评标准,项目,检验内容,质量标准,分值,分值,分,血片制作,（,80,分）,厚血膜（,40,分）,血量（,10,分）,4,5,l,10,略多或略少,7,过多或过少,5,位置（,10,分）,玻片右,1/3,10,稍偏右,7,偏右过多,5,直径（,10,分）,0.8,1.0cm,10,0.7,0.8,或,1.0,1.2cm,8,1.2cm,5,外观（,10,分）,圆形厚膜均匀，边缘整齐,10,圆形稍不均不整齐,8,厚薄不匀影响着色,5,薄血膜（,40,分）,血量（,10,分）,1,1.5,l,10,略多或略少,7,过多或过少,5,位置（,10,分）,长度（,10,分,),外观（,10,分,),玻片,1/2,1/3,处,10,稍偏右或偏左,7,偏右或偏左过多,5,2.5,2.0cm,10,稍大或稍小,8,过多或过少,5,舌状厚薄均匀,10,舌状稍不均,8,厚薄不匀呈波浪型,5,血片染色质量（,10,分）,外观（,4,分）,蓝紫色,4,深蓝色,3,深红色或灰白色,2,镜下（,6,分）,白细胞、疟原虫胞浆蓝色，核红色,6,染色过深，原虫胞浆与核均呈深蓝色,4,染色过浅，胞浆蓝色不易显见，核淡红,3,血片清洁度（,10,分）,外观（,5,分）,光洁无油灰,5,稍有油污,4,油灰粘连,2,镜下（,5,分）,无沉渣,5,稍有沉渣,4,沉渣多或有杂菌,3,疟原虫的镜检技术制片染色,第21页,影响染色效果原因,血片染色好坏除与玻片清洁度、血片制作质量和染色技术等相关外，还受到以下原因影响：,（,1,）染剂、溶剂质量,染料、甲醇和甘油必须用分析纯，且在配制时所用器具必须洁净且无水份。,（,2,）染液新旧,染液存放时间越久，染色力越强。新配制染液因色素还未充分溶解，染色力较弱且常展现偏碱性。通常在染液配制,1,2,周后才使用，盛装染液瓶子应加塞盖密，以防吸潮而影响染液质量。,（,3,）染液稀释后使用时间,必须现用现稀释染液，当初使用，,普通在,0.5h,内染色力最强,。姬氏和瑞氏染液主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生天青，三者能在甲醇中溶解，但在水溶液中伊红碰到美蓝和天青即产生沉淀。,疟原虫的镜检技术制片染色,第22页,影响染色效果原因,（,4,）染液稀释浓度,染液浓度高，着色就快而深，疟原虫寄生红细胞薛氏点粗大显著，但颜色常偏碱；染液浓度过低则染色时间久，颜色偏酸，薛氏点不显著或消失。,（,5,）染色时间,染色时间应依据染液质量、新旧、稀释浓度和气温而适当增减。,染色时间长染色效果好，反之较差。室温高则着色快，染色时间可略缩短，气温低可适当延长。,（,6,）染色用水,染液稀释用水和染色后冲洗用水应选择,pH7.0-7.2,缓冲液（,Na,2,HPO,4,KH,2,PO,4,）,，也能够使用,新鲜蒸馏水,或,过滤冷开水,。在现场无上述条件时也可用,井水、河水、泉水或雨水,。,（,7,）冲洗方法,应沿玻片或染色缸边缘加水使染液表面一层溢出，并轻轻冲洗，以免染液色素颗粒附着于血膜。,疟原虫的镜检技术制片染色,第23页,血片染色注意事项,配置母液时,过滤,可除去杂质颗粒，有利于提升镜检质量。,固定薄血膜时,勿将,甲醇触碰,到,厚血膜。,冲洗染液时，水流,轻缓,，勿冲走厚血膜。,疟原虫的镜检技术制片染色,第24页,原虫密度计算,预计疟原虫感染程度有三种方法：,半定量计数法 检验厚血膜,白细胞原虫密度计数法检验厚血膜,红细胞感染率计算法检验薄血膜,白细胞疟原虫密度计数法（,WHO,推荐,）,用于疟疾研究,用于临床诊疗,用于抗疟后疟疾考评,疟原虫的镜检技术制片染色,第25页,用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫平均数粗略地预计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数疟原虫数受血膜厚薄影响，,只能定性,，,不宜作定量分析,。,我国常见。此方法将密度分为,6,级：,全厚血膜查见疟原虫数在,10,个以内，统计实际数字,全厚血膜查见疟原虫数在,10,个以上，但平均每个视野不到,1,个虫，统计,“,少,”,平均每个视野,15,个虫，统计,“,”,平均每个视野,610,个虫，统计,“,+,”,平均每个视野,11100,个虫，统计,“,+,”,平均每个视野,100,个虫以上，统计,“,+,”,半定量计数法,疟原虫的镜检技术制片染色,第26页,在厚血膜，按要求选择视野，计数,200,个,白细胞，同时计数观察到疟原虫数，假如原虫密度较低，可增加白细胞计数（,500 1 000,个）。,白细胞疟原虫计算公式：,疟原虫数,计数白细胞数,患者每微升血白细胞数,=,疟原虫数,/l,血。,假如不知患者白细胞数，则每微升血以,8000,个,白细胞计算,(,国际标准,),，我国按,6000,个白细胞计算。,白细胞疟原虫密度计数法,疟原虫的镜检技术制片染色,第27页,白细胞疟原虫计数法举例,假设计数,200 WBC,同时，计数了,40,个疟原虫，在不知患者白细胞数情况下，以每微升血,8 000,个白细胞为数,由此计算出每微升血液疟原虫密度为：,40,（原虫数）,200,（白细胞数）,x 8000=1600/l,血,疟原虫的镜检技术制片染色,第28页,从血膜左上角开始，横向。计数,1,个视野后间隔,5,个视野再计数。适合用于疟原虫密度较高时。,在,1,个视野中，有时会重复计数。先把视野分成,4,个象限，从右上象限起顺时针方向计数整个视野。,计数方法,疟原虫的镜检技术制片染色,第29页,疟原虫的镜检技术制片染色,第30页,疟原虫的镜检技术制片染色,第31页,薄血膜不一样区域红细胞疟原虫感染率有较大差异，通常血膜,后端和边缘部,疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检验一个角落，应顺玻片横轴检验。,镜检时，应该统计下所观察到各种疟原虫，不要笼统地记作混合感染。,红细胞感染率计算法（薄血膜）,疟原虫的镜检技术制片染色,第32页,疟原虫密度,=,红细胞原虫感染率,X,红细胞数,/,微升血,红细胞原虫感染率（,%,）,=,疟原虫数,计数红细胞数,X 100%,涂制薄血膜同时，计数每微升血液中红细胞数，也可按男性,500,万个,/,微升血、女性,450,万个,/,微升血计算。,疟原虫密度较高时，检验,1000,个红细胞即可，密度低时，可按公式,N=45.5 X,（,I,P,）,P,计算需要检验红细胞数。,N,为需要检验红细胞数，,P,为,1,万个红细胞中疟原虫数，,I,为血样单位（以,1,万个红细胞计算），,45.5,为常数。,疟原虫的镜检技术制片染色,第33页,