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综合性实验项目指导书
《微生物工程》

编写单位： 生命科学学院
编写教师： 闫训友
适用专业： 生物技术
编写日期： 2011.5.10

综合性实验项目名称（黑体，四号，全文1.5倍行距）
一、实验项目：液体培养阿魏侧耳发酵液动态变化
实验学时：8学时
实验类型：（综合）
每组人数： 5 人/组
二、实验目的及要求
通过本实验的学习，使学生学会液体培养阿魏侧耳的原理和方法，掌握液体培养条件下的无菌技术，掌握液体培养条件下各因子的动态变化，掌握发酵终点的判断及污染处理，为今后从事于微生物发酵奠定基础。）
三、实验主要仪器和制剂
主要仪器：恒温振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、分析天平、电磁炉、分光光度计、移液管等。
试剂：蒽酮试剂、3,5-二硝基水杨酸、PDA液体培养基、平菇等
四、实验内容（一级标题：黑体，小四号。下同）
配制PDA液体培养基，选择长势良好的菌丝，无菌操作挑取数片菌丝，接入液体培养基中，26℃条件下振荡培养，分别取培养0、1、2、3、4、5、6天的培养液，测定发酵液还原糖、总糖、多糖等指标的含量变化，探讨引起指标变化的原因。

五、实验实施步骤
（一）制备PDA液体培养基
1.PDA液体培养基配方：
马铃薯20%，蛋白胨0.4％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，pH自然。
2.配制、分装、高压灭菌：
按照培养基配置的一般方法进行配制液体培养基，并于500mL三角瓶中，分装150mL PDA液体培养基，于121℃下，灭菌30min。
（二）接种培养：
1.取平板菌丝体，利用接种刀均匀划分等量大小的菌丝体。
2.分别在4个装有PDA液体培养基的三角瓶中，等量接入平菇菌丝体。
3.将接有菌种的PDA液体培养基放入27℃下培养。
（三）取样
分别取接种当天、3天、4天、5天、6天、7天的发酵液。
（四）指标测定
1.还原糖测定按照3,5-二硝基水杨酸的方法。
2.总糖测定按照蒽酮硫酸比色法测定。
3.多糖测定按照多糖=总糖-还原糖
（五）发酵终点的判断
按照发酵液颜色、发酵液粘稠度、菌丝状态、还原糖、多糖、总糖的变化进行判断发酵终点。
六、思考问题
导致液体培养条件下污染的因素有哪些，实验过程中如何避免杂菌的污染，如何正确判断发酵终点？
七、实验报告
在实验报告要包括实验目的及要求、实验内容、实验步骤、实验结果与分析，明确实验结果是否与理论相符，如果不符，分析出具体原因及改进措施。
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述、实验步骤、操作过程、实验结果、对实验结果的分析，改进措施和注意事项。其中原理描述、实验步骤和操作过程清楚正确的60分，实验结果与分析正确90分，改进措施和注意事项合理完备的100分。

设计性实验项目指导书
《生物技术综合实验》

编写单位： 生命科学学院
编写教师： 闫训友
适用专业： 生物技术
编写日期： 2011.5.17

设计性实验项目名称（黑体，四号，全文1.5倍行距）
一、实验项目：液体培养药用真菌发酵液多糖的提取与纯化
实验学时：8学时
实验类型：（设计性）
每组人数： 5 人/组
二、实验目的及要求
通过本实验的学习，使学生学会从发酵液中提取多糖的原理和方法，掌握液体离心、发酵液处理的技术，发酵液中多糖的纯化方法，掌握冷冻干燥的技术操作，为今后从事于微生物发酵奠定基础。）
三、实验主要仪器和制剂
主要仪器：离心机、冷冻干燥机、鼓风干燥箱、恒温水浴锅、量筒、烧杯、冰箱等。
试剂：95%乙醇10瓶，工业酒精10L，乙醚2瓶、丙酮2瓶等。
四、实验内容（一级标题：黑体，小四号。下同）
发酵液离心、发酵上清液的收集、发酵上清液浓缩、发酵液除蛋白、醇沉多糖、多糖的制备、多糖的纯化，多糖的结晶。

五、实验实施步骤
（一）发酵上清液的制备
振荡培养 7d后，从摇床中取出三角瓶，将其在 4000r/min，20min的条件下离心，取其上清液。
（二）多糖的提取工艺
将离心得到的发酵上清液在不大于 90℃的条件下浓缩至原体积的 1/4[11]，浓缩液在 4000r/min，20min的条件下离心，在提取剂为乙醇，乙醇浓度为80％，提取温度为80℃，提取时间为2.5h小时条件下提取多糖，再将提取液在 4000r/min，20min条件下离心，所得沉淀即为粗多糖。
（三）多糖纯化

对制备的多糖，经过纯丙酮反复洗涤，离心后得到固体粉末，再经过乙醚洗涤，洗去色素等杂质，最后得到较好的固体。
（四）多糖的干燥
对制备的多糖，在冷冻干燥机内进行冷冻干燥。

六、思考问题
影响液体多糖提取的因素有哪些，实验过程中如何避免减少多糖的得率？
七、实验报告
在实验报告要包括实验目的及要求、实验内容、实验步骤、实验结果与分析，明确实验结果是否与理论相符，如果不符，分析出具体原因及改进措施。
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述、实验步骤、操作过程、实验结果、对实验结果的分析，改进措施和注意事项。其中原理描述、实验步骤和操作过程清楚正确的60分，实验结果与分析正确90分，改进措施和注意事项合理完备的100分。

设计性实验项目指导书
《微生物工程》

编写单位： 生命科学学院
编写教师： 闫训友
适用专业： 生物技术
编写日期： 2011.6.1

设计性实验项目名称（黑体，四号，全文1.5倍行距）
一、实验项目：淀粉质原料的酒精发酵
实验学时：10学时
实验类型：（设计性）
每组人数： 5 人/组
二、实验目的及要求
通过本实验的学习，使学生学会液体发酵酿制米酒的技术，熟悉高温灭菌技术，掌握酒精蒸馏的方法和步骤，学会测定酒精的方法步骤，为今后从事于微生物酒精发酵奠定基础。）
三、实验主要仪器和制剂
主要仪器：恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、分析天平、电磁炉、酒精计、移液管等。
试剂：酒曲，大米、罐头瓶等
四、实验内容（一级标题：黑体，小四号。下同）
淘洗浸泡糯米（淘洗3次，浸泡3~5小时，浸泡后的大米应保持完整，手捻易碎，断面无硬心）
蒸饭(时间25~30分钟，要求蒸出的饭粒外硬内软，内无白心，不糊不烂)
冷却：摊晾法，晾到饭温为30°左右
拌曲（拌曲量一般为米重的0.2%~0.3%）
糖化发酵（温度在28°~30°，一般2~3天即可来酒，香-甜-烈）
成熟出汁
酒渣分离
酒精含量的测定。

五、实验实施步骤
（一）原料制备
1.原料选择
选择色泽良好、无虫蛀、无霉变的优质精白长形糯米和大米。
2.浸泡
将大米（糯米）淘洗干净后再浸泡，让米充分吸水。浸泡4～5（15小时，浸泡后的糯米粒应保持完整，手捻易碎，断面无硬心，吸水量以25%～30%为宜。
3.蒸饭
将浸好的糯米用干净纱布包好，放入高压灭菌锅内蒸熟。米层厚度控制在10厘米左右，蒸饭时间控制在30～35分钟，要求蒸出的饭粒外硬内软、内无白心、不糊不烂。
4.冷却
采用摊晾法，将饭粒于无菌条件下摊开冷却到30℃左右。
5.入罐拌曲
将摊晾的米饭装入罐中，酒曲按照比例，拌入冷却的糯米饭中。
（二）发酵培养
前期进行糖化，品温控制在28℃~32℃，经过36h~48h 出现酒液，酒液达饭堆的4/5 高度时，可进行开扒搅拌，促进酵母繁殖。主发酵，品温控制在22℃~26℃，发酵48h~72h。
（三）酒样理化指标的测定
1.可溶性糖的测定：蒽酮比色法测可溶性糖
1.1葡萄糖标准曲线的制作
称取2g蒽酮溶于1000ml 85％的硫酸中，即为蒽酮试剂。准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容到100ml，即为0.2mg/ml葡萄糖标准液。
取6支试管按表2加入试剂后冰浴5min，每管加入4ml蒽酮试剂，沸水浴10min，流水冷却，静置10min，在620nm波长下测定吸光度，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线，见附录1。

表2 蒽酮比色法测定可溶性糖的标准曲线
管号
0
1
2
3
4
5
0.2mg/ml葡萄糖标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
蒸馏水（ml）
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

1.2蒽酮比色法测定酒样可溶性糖的含量
取酒样，稀释到1000倍，按表3加入试剂，以1号试管作为对照管，2，3，4号试管在波长620nm条件下比色测得OD值后，从标准曲线上查出样品液相应的可溶性糖含量。
表3蒽酮比色法测定酒样中的可溶性糖
试管号
1
2
3
4
样液（ml）
0
1.0
1.0
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0
0
0
蒽酮（ml）
4.0
4.0
4.0
4.0

2.酒精度的测定：采用蒸馏法[5]
用容量瓶量取100mL酒样于500mL蒸馏瓶中，加100mL蒸馏水和数粒玻璃珠，装上冷凝器，以原100mL容量瓶接收馏出液(外加冰浴)，然后开启电炉缓缓加热蒸馏，收集约95mL馏出液时，取下，加蒸馏水定容至100mL，摇匀，备用。将上述制得的酒样倒入洁净、干燥的量筒中，静置数分钟，待酒中气泡消失后，放人洗净、擦干的酒精计，再轻轻按一下，静止后，水平观测与弯月面相切处的刻度示值，同时插入温度计记录温度，根据测得的温度和酒精计示值，查GB/T 10345-2007中的附录二，换算成20℃时的酒精度％(体积分数)。

六、思考问题
导致酒精发酵中的污染的因素有哪些，实验过程中如何避免杂菌的污染？
七、实验报告
在实验报告要包括实验目的及要求、实验内容、实验步骤、实验结果与分析，明确实验结果是否与理论相符，如果不符，分析出具体原因及改进措施。
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述、实验步骤、操作过程、实验结果、对实验结果的分析，改进措施和注意事项。其中原理描述、实验步骤和操作过程清楚正确的60分，实验结果与分析正确90分，改进措施和注意事项合理完备的100分。

综合性实验项目指导书
《微生物工程》

编写单位： 生命科学学院
编写教师： 闫训友
适用专业： 生物技术
编写日期： 2011.5.20

综合性实验项目名称（黑体，四号，全文1.5倍行距）
一、实验项目：小型发酵罐的操作和维护
实验学时：4学时
实验类型：（综合性）
每组人数： 5 人/组
二、实验目的及要求
掌握自控发酵罐的构造、原理及操作程序，掌握分批灭菌的操作方法，学习在实验室内大规模培养微生物细胞的方法。为今后从事于微生物发酵奠定基础。）
三、实验主要仪器和制剂
主要仪器：恒温振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、分析天平、小型发酵罐、20L自控发酵罐、空压机及储气罐、蒸汽发生器、棉花，工业酒精，打火机
试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基、菌种等
四、实验内容（一级标题：黑体，小四号。下同）
准备工作、仪器线路连接、蒸汽发生器的操作、分批灭菌、接种、操作界面的设置、发酵管理、放料。
五、实验实施步骤
• （一）准备工作:
1. 空气源的检查，并将空压机打开，使气压达到0.2～0.25MPa。
2. 管道、阀门的检查，关闭所有阀门，打开蒸汽发生器，使汽压达到0.12～0.14MPa。
3. 电器仪表的检查，关闭控制台电源。
• （二）实罐灭菌
1.检查夹套排水阀F33是否打开，夹套水是否排尽（可利用F5加压排夹套中水）。
2.夹套预热：关闭F34、F31（不进冷水）,打开F5、F33（蒸汽加热）,接通电源，开电源开关，手动开启搅拌电机，调节电机转速至150rpm左右（预热均匀、快速），进行慢速搅拌。
3.发酵罐内的温度达到80℃左右时关闭与调小F5，打开F4、F22，排尽蒸汽管中冷凝水后即关闭F22；稍开F21，使蒸汽徐徐进入发酵罐；继续升温。
4.此时应关闭进气阀F13，将排气阀F14调为微开。
5.当培养液温度达到95~100℃后，可停止搅拌（因物料已经沸腾，不需搅拌）。当发酵罐内温度达到灭菌要求时（ 121 ℃ ），阀门F4、F14处于微开状态；时刻注意罐压，并控制在0.1～0.11MPa之内，严禁超压。
罐压的控制通过调节阀门F5（可关）、F4、F14来实现。
6.注意在升温过程中不要开冷却开关，否则当温度设定值设定在培养温度时，冷却水管中会自通冷却水，不仅会影响升温速度，浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，引起培养液浓度变化或不能达到灭菌温度。
实消时间一般为30分钟。到时间后，关闭F4、F5、F14，自然冷却10min左右。
7.通冷却水进行冷却，操作如下：关闭夹套排水阀F33，按冷却键，至手动冷却状态；或调整温度设定值，按冷却键至自动状态；此时起即进入控温状态。
8.当蒸汽阀门关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.03MPa时，必须间隙开启进气阀F13，让空气进入发酵罐内，并保持压力在0.03~0.05MPa之间。
9.当罐内温度降至70℃以下时，调节搅拌电机的调速器，慢速搅动培养基，加快冷却速度；同时可稍开进气阀F13和调节排气阀F14使罐压保持在0.03~0.05MPa之间。
• （三）接种
接种方法可采用火焰接种法。
在接种口用酒精火圈消毒，然后打开接种口盖，迅速将接种液倒入罐内，在把盖拧紧。
六、思考问题
1.必须确保所有单位设备能正常运行时使用本系统.
2.在过滤消毒时,流经空气过滤器(金属滤芯)的蒸汽压力不得超过0.17MPA,否则过滤器滤芯会被损坏,失去过滤能力.
3.在操作过程中,罐压不得超过0.12MPA,防止引起设备的损坏.
七、实验报告
在实验报告要包括实验目的及要求、实验内容、实验步骤、实验结果与分析，明确实验结果是否与理论相符，如果不符，分析出具体原因及改进措施。
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述、实验步骤、操作过程、实验结果、对实验结果的分析，改进措施和注意事项。其中原理描述、实验步骤和操作过程清楚正确的60分，实验结果与分析正确90分，改进措施和注意事项合理完备的100分。

实验一、实验名称：α-淀粉酶活性的检测

试验学时：2学时
实验类别：必做
实验性质：验证性
实验目的：学会测定α-淀粉酶活性的原理和方法，掌握可溶性淀粉配制的方法。
实验内容：配制一定浓度的α-淀粉酶溶液，标准糊精溶液和标准稀碘液，以糊精和标准稀碘液的颜色作为对照，在比色板里面滴加比色稀碘液，利用大试管加入淀粉液和水，保温一段时间后，加入α-淀粉酶液立即记录时间，每20秒取反应液加入比色碘液中，等出现和对照颜色相同时，记录时间。按照公式计算α-淀粉酶的活性。
主要仪器：离心机、比色板

实验原理
α-淀粉酶，又称为1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，广泛存在于动、植物和微生物体中，如麦芽或动物的唾液、脾脏中均含有较多的α-淀粉酶，而当今α-淀粉酶的工业化生产也主要是利用微生物工程菌进行生产的。
α-淀粉酶容易溶解于水和较稀的缓冲液中，它能够切断淀粉分子中的α-1，4糖苷键，生成糊精及少量麦芽糖或葡萄糖，从而使淀粉遇碘变蓝的特异性颜色反应逐渐消失，由此颜色反应消失的速度即可测出该酶的活性。α-淀粉酶活力（）可用60℃时1克酶制剂或1ml酶液在1小时内液化可溶性淀粉的克数来表示，单位以g/g（ml）·h来表示。计算公式为：α-淀粉酶活力（）=f×（'6060°Dt60×20×2%）/0.5=48×tf
式中f为酶的稀释倍数（400），t为反应时间，以min表示。
仪器与材料
1、试剂：原碘液，标准稀碘液，比色稀碘液，标准糊精，2%可溶性淀粉溶液（现用现配），pH 6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
2、其它：比色板，50ml、500ml烧杯，1ml、5ml吸管，20ml移液管，长滴管，
50ml、100ml、500ml量筒，15×150mm、25×200mm试管，水浴锅。
方法
1、1%α-淀粉酶液：称取α-淀粉酶0.5g，加pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解后定容至50ml。在40℃水浴中恒温20min后，以4层纱布过滤，并将滤液收集在50ml小三角瓶中，稀释4倍后使用。注意：现测现配。
2、在15×150mm试管中分别加入1ml标准糊精液和3ml标准稀碘液，充分混匀后，作为比较颜色的标准管，并取3滴加入到比色板的第1穴内。
3、在比色板的每1穴内滴3滴比色稀碘液，备用。
4、在25×200mm试管中，分别加入20ml 2%可溶性淀粉液和5ml pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，混合后于60℃水浴中平衡温度10min，再加入0.5ml稀释酶液，充分混匀后即刻记时。每隔20s取出1滴酶反应液于比色板中进行显色。当反应颜色由蓝转为棕橙色，并与标准比色管颜色相同时，即为反应终点，记录此时间t。注意：测定液化时间应控制在2～3min内。
5、根据公式计算α-淀粉酶活力。

附：
（1）原碘液：分别称取碘1.1g，碘化钾2.2g，先用少量蒸馏水将碘化钾全
部溶解后，再加入碘，至其也全部溶解后，加水定容至50ml，并贮存于棕色瓶内。
（2）标准稀碘液：称取碘化钾1.6g，加少许蒸馏水溶解后，再加原碘液3ml，并定容至100ml。
（3）比色稀碘液：称取碘化钾20g，加少许蒸馏水溶解后，再加原碘液2ml，并定容至500ml。
（4）标准糊精：称取0.3g糊精，悬浮于少量蒸馏水中，再加入少许沸水至
溶液透明后，滴入几滴甲苯，并定容至500ml，贮存于冰箱中。
（5）2%可溶性淀粉溶液：称取20g可溶性淀粉，先以少许蒸馏水调成糊状，
再加入少量沸水至溶液完全透明后，定容至1000ml。注意：现用现配。
（6）pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：分别称取磷酸氢二钠（NaHPO4·12H2O）113.8g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）20.17g，加蒸馏水溶解后定容至2500ml。