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高效液相色谱法在手性药物拆分中的应用

摘要：外消旋化合物的手性分离是获得单一对映体的方法之一。随着人们对纯光学药物的需求日益增加，各种手性分离技术得以快速发展。近几十年来，在这些手性分离技术中，高效液相色谱法 ( HPLC ) 被公认为是一种强大、快速、高效的分离技术，它已成功应用于对映体药物的分离分析和制备中。HPLC用于对手性药物分离的研究已取得很大进展，并且研发了大量可应用于手性小分子和聚合物分离的手性固定相，大大提高HPLC的手性识别能力。本文以HPLC的手性药物分离为焦点，介绍了近几年高效液相色谱法手性固定相的新发展和应用。
关键词：高效液相色谱法 手性药物 手性拆分

Application of High Performance Liquid Chromatography in Chiral Separation of Pharmaceuticals

Abstract：Resolution of racemic compounds is one of the potential ways of obtaining both enantiomers. The increasing demand for enantiopure drugs has led to the development of a variety of stereoselective separation technologies. Among several resolution techniques in the past few decades, high performance liquid chromatography ( HPLC ) is well recognized as a powerful, fast and efficient technique, which has been successfully employed for analysis and preparation of enantiomers of drugs. Enantioseparation by HPLC has significantly advanced, and a large number of chiral stationary phases ( CSPs ) for HPLC have been developed using both chiral small molecules and polymers with chiral recognition abilities. This review focuses on various HPLC methods for chiral separation of pharmaceuticals, many new developments and applications are introduced in chiral stationary phase of HPLC in recent years.
Keywords：HPLC; Chiral drug; Chiral separation;

引 言
手性药物是指药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体，是目前药物研究领域的热点之一。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别。而手性在自然界中是普遍存在的，并且人体本身就是一个手性环境，比如蛋白质、多糖、核酸和酶等大都是手性的。绝大多数的药物由手性分子构成。虽然它们的理化性质相似，但在生物体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。由于酶、受体、载体等分子都是具有手性特征的物质,手性药物的不同对映体在生物体内的吸收、转运、分布、代谢、排泄等存在显著的差异，甚至能够产生意想不到的毒性作用[1, 2]。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害。比如，(S) -构型多巴为治疗帕金森综合症的首选药物，而(R) -构型能造成粒状白细胞减少症，使用极度危险；著名的“反应停事件”，R-反应停具有镇静作用，而S-反应停则对胎儿有致畸作用。
手性制药是医药行业的前沿领域，2001年诺贝尔化学奖就授予分子手性催化的主要贡献者。不同手性药物在体内发挥的作应不同，一种可能是高效低度的，而另一种可能有毒害作用。手性制药就是利用化合物的这种原理，开发出药效高、副作用小、药物的专一性高的药物。据调查，1985 - 2004年上市的550个新化学合成药物中，有313个药物具有手性中心，其中以单一异构体上市的手性药物为167个，手性药物数量呈逐年上升趋势；2005年世界药物的销售总额为6020亿美元，而手性药物的销售总额为2250亿美元，占全球制药市场销售总额的37 %，2010年可望超过5000亿美元[3, 4]。
一般情况下获得手性化合物有以下几种方法：天然物的提取、生物合成、外消旋体拆分、不对称合成等方法[5]。外消旋体拆分主要有：经典结晶法拆分、动态动力学拆分、色谱法拆分、膜拆分法、萃取拆分法等技术[6, 7]。本文重点介绍色谱法中HPLC在手性药物拆分中的应用。
1 高效液相色谱法简介
高效液相色谱法( High Performance Liquid Chromatography , HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”等。HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱仪可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分
高效液相色谱的发展始于20世纪60年代中后期。60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度。1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划、蛋白质组学用HPLC做预分离等。现在该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱法有如下特点：(1) 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。(2) 高效：分离效能高，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。(3) 高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。(4) 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。(5) 分析速度快、载液流速快：通常分析一个样品在15 - 30分钟。此外，高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
2 高效液相色谱的手性拆分方法
高效液相色谱技术在手性药物拆分中应用最广泛的方法之一，在手性药物质量控制、立体选择性的药理学和毒理学研究等方面起着极其重要的作用。HPLC对药物对映体的分离方法主要分间接法和直接法。
2.1 间接拆分法
间接法又称衍生化法，是手性化合物对映体在分离之前把手性药物对映体混合物在预处理液中进行柱前衍生化，形成一对非对映异构体，溶质分子与固定相和流动相之间作用力不同，发生差速迁移，对映体分子实现分离。常用的手性衍生化试剂主要有：酰化试剂、胺类试剂、氯甲酸酯类和邻苯二醛等。
如Bhushan R等[8]合成琥珀- (S) -萘普生酯，并用它做衍生化试剂处理DL -青霉胺对映体，采用反相高效液相色谱法进行分离，分离效果很好。Peccinini RG等[9]使用C18柱，(-) -氯甲酸薄荷酯作为衍生试剂处理血浆和尿液中的卡维地洛，用氯仿提取，用荧光检测器检测，对映体分离较好。该方法可应用于对映选择性的药代动力学研究。Bhushan R等[10]考察了二氯- S -三嗪和一氯- S -三嗪作为氨基酸的衍生化试剂，产生的对非对映体用反相C18柱分离，流动相为乙腈和三氟乙酸水溶液的混合物，实验结果说明，这两种试剂可以安全地用于氨基酸的手性分析药物分离。手性试剂衍生化法多用非手性柱即可分离，但是需要较高纯度的衍生试剂，衍生化反应要严格控制，对不同的药物要寻找相应的衍生化试剂，且操作比较麻烦，只可在小范围内应用。在HPLC中，直接法应用较多，手性添加剂和手性固定相种类多样。
2.2 直接法
2.2.1 手性流动相添加剂法
手性流动相添加剂法是在流动相中加入手性添加剂，然后利用非手性固定相进行拆分。常用的手性流动相添加剂有：手性离子对、CD、冠醚、手性金属配合物、动态手性固定相等。最常用的添加剂为环糊精。如郭娜等[11]采用 C18固定相，以羟丙基- β -环糊精为手性流动相添加剂，建立了奥昔布宁对映体的高效液相色谱拆分方法。该法拆分奥昔布宁对映体，方法简单，灵敏度高，分离度好。刘学斌等[12]建立拆分新药尤利沙星对映异构体的 HPLC手性流动相添加剂法。本文利用尤利沙星对映体与手性添加剂L -异亮氨酸和 Cu2+ 间形成三元非对映体配位化合物，在较短时间内能达到理想的分离效果。
2.2.2 手性固定相法
目前认为手性固定相法是非常简单而有效的方法，应用也最为广泛，可分离的手性药物多。手性固定相法是将手性试剂化学键合到固定相上制成手性柱，外消旋体中的一个手性物质与手性固定相发生作用，生成不稳定的短暂复合物，而两者在固定相中的保留时间不同，从而达到分离的目的。CSP法发展异常迅速，手性固定相的种类大致有以下几类：手性聚合物类、刷型手性固定相、蛋白质类、大环抗生素类、分子印迹聚合物、冠醚类、多糖类和环糊精类等[13]。本文对几种常用的手性固定相做一简单介绍。
3 高效液相色谱常用的手性固定相
3.1 蛋白质类手性固定相
蛋白质是一类复杂的高分子聚合物，所含手性亚单位L -氨基酸具有手性特异性,能特异性地结合小分子，因此对手性分子具有很强的识别能力。HPLC 蛋白质手性固定相主要有:人α1 -酸性糖蛋白、牛血清白蛋白、卵黏蛋白和纤维素二糖水解酶等[14]。Mallik R等[15]制备了基于硅固定化 α1 -酸性糖蛋白的手性固定相，用它分离华法令和普萘洛尔对的映体异构体，分离结果良好。尹燕杰等[16]研究盐酸昂丹司琼对映体在纤维素衍生物及蛋白质固定相上的保留行为，以 Chiral CEL OJ和Ultron ES - OVM 为固定相，优化色谱条件，并测定盐酸左昂丹司琼( R )中右旋异构体( S )的含量。作者所建立的方法均可方便地分离盐酸昂丹司琼对映体并测定盐酸左昂丹司琼原料和注射液中右旋异构体的含量。林丽娜等[17]以 α1 -酸性糖蛋白为固定相，建立甲溴后马托品溴化物及硫酸阿托品的对映体拆分方法，采用HPLC法分离，结果甲溴后马托品溴化物及硫酸阿托品对映体可以在 α1 -酸性糖蛋白固定相上得到完全分离。
3.2 多糖类手性固定相
多糖类手性固定相包括纤维二糖、棉子糖、乳糖、纤维素、淀粉及它们的衍生物。Peng, L等[18]用氯甲基氨基甲酸苯酯衍生直链淀粉和纤维素做为RP-HPLC的手性固定相，考察它们的分离性能。结果发现，3 -氯- 4 -甲基氨基甲酸苯酯衍生的纤维素和 2 -氯- 5 -甲基氨基甲酸苯酯衍生的直链淀粉的分离效能，比传统的二甲基氨基甲酸苯酯衍生直链淀粉和纤维素要好得多。Caccamese S等[19]利用手性多糖固定相和酸性添加剂，采用高效液相色谱法分离的芳香胺对映体和四个氨基醇对映体。纤维素和直链淀粉衍生的手性固定相有不同的对映体分离能力，该实验使用一种酸性添加剂加在流动相中，提高手性柱的分离效果。黄虎等[20]考察了多糖类手性固定相在含有酸性或碱性添加剂的流动相下高效液相色谱法拆分 β受阻滞剂对映体的效果，在直链淀粉-三( 3, 5 -二甲基苯基氨基甲酸酯)衍生物手性固定相( Chiralpak AD 和 Chiralpak IA)上拆分 β受体阻滞剂对映体，酸性添加剂的流动相体系与碱性添加剂的流动相体系相比，碱性添加剂的流动相的拆分效果比酸性添加剂的流动相要好。另外，赵峰等[21]葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、棉子糖、乳糖的对甲基苯甲酸酯经过 3 -异氰酸丙基三乙氧基硅烷键合到硅胶上作为高效液相色谱的手性固定相，对16种外消旋体化合物进行了拆分。结果表明，它们的对甲基苯甲酸酯手性分离柱分别分开了8、6、10、4、5对外消旋体化合物，并且这些手性固定相之间还具有好的手性识别互补性。
3.3 环糊精类手性固定相
环糊精(CD)及其衍生物是最常用的手性选择剂。CD是一种水溶性的大环寡聚葡萄糖，通常由6 - 12个互为椅式构象手性D - (+)葡萄糖单元通过 α - ( 1, 4 ) -糖苷键连接而成。根据其结构不同可分为 α -环糊精、β -环糊精和 γ -环糊精，其中 β -环糊精应用最多。常用衍生化环糊精有：2, 6 -甲基- β -环糊精 ( DM - β - CD )、2, 3, 6 -三甲基- β -环糊精( TM - β - CD ) 、2 -羟丙基- β -环糊精( HP - β - CD )、羧甲基- β -环糊精( CM - β - CD )，都己成功的用于一些手性化合物的拆分[22]。Thamarai Chelvi SK等[23]用溴取代 [ 3- ( 2- O - β -环糊精)- 2 -羟基丙氧基] 丙基硅制备的手性固定相，该固定相在正相和反相条件下，对芳香位置异构体和一些芳香族化合物异构体显示良好的选择性。周婕等[24]用分步法制备全苯异氰酸酯基- β -环糊精键合硅胶手性固定相，在高效液相色谱仪上，对氟西汀对映体进行拆分，并探讨流动相组成及配比、离子强度、pH 值、流速和柱温等影响分离的因素，结果表明，在自制手性固定相上外消旋氟西汀得以拆分。
3.4 冠醚类手性固定相
20 世纪 60年代，美国杜邦公司的C.J.Pedersen在研究烯烃聚合催化剂时首次发现冠醚。冠醚的空穴结构对手性药物有选择作用，它主要分离机制是氧原子与对映体的氢原子之间形成氢键，对映体与其存在静电和位阻作用。常见的冠醚有15 -冠- 5和18 -冠- 6。手性冠醚作为手性选择因子，适用于伯胺类化合物和氨基酸的对映体的分离。其中，(18 -冠- 6)- 2, 3, 11, 12 -四羧酸的应用越来越受到重视。如Jeon SH等[25]用(-) - ( 18 -冠- 6 ) - 2, 3, 11, 12 -四甲酸作为手性固定，分离六个不同的L -甲状腺素产品和四个市售的D - 和 L -甲状腺素试剂，实验结果良好。金京玉等[26]利用高效液相色谱法，采用(18 -冠- 6)- 2, 3, 11, 12 -四羧酸衍生的冠醚为手性固定相，对非甾体抗炎药酰肼衍生物进行手性分离研究，利用此冠醚衍生的手性色谱柱，可拆分手性酸的酰肼衍生物的对映体，此分析方法也适用于其它多种手性酸化合物的对映体的拆分研究。
3.5 配体交换手性固定相
配体交换色谱法( ligand exchange chromatography, LEC )是由Davankov等发展的一种高效手性色谱分离方法。该类固定相多为手性氨基酸或其衍生物与二价金属离子(Cu2+、Ni2+、Zn2+ 等) 鳌合形成的金属离子络合物，待测对映体与配位体可形成2个非对映的三元络合物，经色谱过程实现光学异构体的立体选择性分离。LEC是目前分离氨基酸对映异构体最有效的方法之一，通常将氨基酸对映体或青霉胺衍生物通过物理吸附或化学键合结合到硅胶上，得到手性配体交换色谱固定相。如Liu Q等[27]建立了氨基酸离子液体作为手性配体手性分离方法。作者用1 -烷基- 3 -甲基咪唑- L -脯氨酸作为一个手性配体与Cu2+ 络合，用HPLC和CE分别对DL -苯丙氨酸、DL -组氨酸、DL -色氨酸和DL -酪氨酸成功分离。马桂娟等[28]以单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯-甲基丙烯酸乙二醇双树脂为载体，制备新型L-羟脯氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相，对衍生和非衍生的D, L -氨基酸和 α -羟基酸等9种手性化合物进行了高效液相色谱拆分，所拆分的9种手性化合物，有5种手性化合物能得到基线分离。
3.6 分子印迹聚合物手性固定相
分子印迹聚合物 ( molecular imprinted polymer, MIP ) 通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。毫无疑问，分子印迹技术正在迅猛的发展，虽然目前主要处于实验室阶段，但其巨大的科研和商业潜力已经展露无余。分子印迹技术的基本过程如下：(1)在一定溶剂（致孔剂）中，模板分子与功能单体之间通过共价或非共价作用形成主客体配合物；(2)加入交联剂，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物；(3)将聚合物中的模板分子洗脱或解离出来。田晓琴等[29]结合 β -环糊精在水相中制备以硅胶为骨架的苯丙氨酸分子印迹聚合物，并进行色谱性能研究，以苯丙氨酸为模板分子，2 -丙烯酸胺基- 2 -甲基- 1 -丙磺酸为功能单体，N, N' -亚甲基双丙烯酸胺为交联剂，采用热聚合法在水相中制得以硅胶为骨架的苯丙氨酸分子印迹聚合物，以此作为固定相，结果苯丙氨酸在印迹柱上的保留比在空自印迹柱上强，与赖氨酸、甫氨酸达到基线分离。银珍红等[30]以2, 4 -氯苯氧乙酸分子为模板，甲基丙烯酸为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酷为交联剂，甲苯和乙二醇为混合致孔剂，采用热引发原位聚合法制备了作为高效液相色谱固定相的分子印迹整体柱，在优化的合成条件下制备的分子印迹整体柱可在15 min 内分离2, 4 -氯苯氧乙酸及其类似物苯氧乙酸，分离度为1. 52。
3.7 刷型手性固定相
“刷型”手性固定相是HPLC 手性固定相中非常重要的一类CSP，这类一般通过一定的间隔臂，连接一个单分子层的手性有机分子到硅胶载体上而制得，因而被称之为“刷型”或“束型”CSP。其化学结构特点是在手性中心附近至少含有下列功能团之一[31]：(1) Π -酸性(带吸电子取代基)或 Π -碱性(带推电子取代基)的芳香基团，在手性识别过程中能发生 Π -电荷转移相互作用；(2)能形成氢键的原子或基团； (3)能发生偶极-偶极叠合相互作用的极性键或基团；(4)能提供立体排斥、范德华相互作用和(或)构型控制的较大的非极性基团。显然，对映体和CSP之间的手性识别是通过上述一种或几种相互作用来实现的。如唐琴等[32]以正己烷-异丙醇二元混合剂体系为流动相，在Whelk - O1、DNB - PG 和 DNB - Leucine 3种刷型手性固定相上将药物丙卡特罗直接拆分为( R, R /S )和( S, R /S )对映体，分离系数值达1.4 - 1.8。张美等[33]采用纤维素-三( 3, 5 -二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷型手性固定相( Chiralcel OD 柱) 、直链淀粉-三( 3, 5 -二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷型手性固定相( Chiralpak AD 柱) 、直链淀粉-三( 3, 5 -二甲基苯基氨基甲酸酯)键合型手性固定相( Chiralpak IA 柱) 和 Pirkle型的( S, S ) - Whelk - 01手性固定相对38种外消旋体化合物进行手性拆分，它们之间的手性识别性能具有一定的互补性。
3.8 大环抗生素类手性固定相
大环抗生素类键合手性固定相已经成为非常有效和流行的手性固定相，它具有多个手性中性，有非常广泛的对映体分离选择性。由于此类固定相的结构中含有多肽、糖类和其它可离子化基团，因此，在不同的洗脱模式下会表现出不同的对映体选择性。其作用机制包括离子作用，氢键作用，Π - Π 键合作用，偶极-偶极作用，络合作用，空间位阻作用等。常用的抗生素有四类[34]：糖肽类，安沙霉素类，氨基糖苷类和大环内酯类抗生素。Mohamde等[35]使用万古霉素手性柱，建立了同时测定血浆和药物制剂中丁呋洛尔对映体含量的 HPLC法。如关瑾等[36]利用反相高效液相色谱法在大环抗生素类手性固定相万古霉素键合手性固定相上直接分离了泰妥拉唑对映体。许哲等[37]采用高效液相色谱法在人环糖肤抗牛素键合固定相手性柱上拆分了卡巴拉汀对映体。
4 小结
手性化合物在医学工业和人体代谢方面重要性已引起人们越来越多的关注，且手性药物分离成为药物研发领域的热点。液相色谱是手性药物拆分的主要方法，应用最为广泛，对大部分手性药物几乎都能实现分离。HPLC手性识别能力除了与映体的结构有关外，其它多种因素如涂层溶剂、溶液pH 值、操作温度等分离条件都会产生大的影响。因此，优化分离条件可提高分离效率。但HPLC手性色谱柱价格昂贵，大大增加应用成本，开发成本低、柱效高的新手性柱高效液相色谱手性固定相的将来发展的一个重要的方向。总之，HPLC在手性药物代谢、质量控制及手性新药研究等方面发挥重要作用，具有十分广阔的应用和发展前景。

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