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检测锌离子的荧光探针
姓名：徐英 学号：51007008 专业：应用化学
摘要：锌是人体必需的微量元素之一，是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质。锌的过量与不足都会导致人体代谢异常，产生疾病，因此，Zn2+含量的测定在临床、医药、食品、环境监测及科研中都有极其重要的意义。本文简要综述了测定细胞内游离锌离子荧光探针物质的化学规律、性质和优缺点。
关键词：Zn2+、荧光探针、定量检测
1、前言
在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第25位，在地壳中的平均含量波动于0.004-0.02%之间。锌是位于元素周期表第II副族的过渡金属元素，具有3d104s2的价电子结构，通常只失去s电子而成+2氧化态。Zn2+的原子半径较小，且因其带两个正电荷，所以它对电子的亲和力很高，是一个强的质子受体[1]。
1940 年Eggleton首先提出人类需要锌[2]。Prasad和Sandstead 等研究明确了锌是人类必需的微量元素[3]。Zn2+是人体内第二富集的过渡金属，广泛分布于人体内部。
据研究表明，锌在许多生理、生化过程中发挥着极为重要的作用，例如:锌离子是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属离子之一；它可作为金属蛋白酶的结构因子或转录因子；可以和许多调控酶相互作用，作为第二信使触发或阻断诸如细胞凋亡等重要生理过程；具有调控大量离子通道的能力，参与神经传导的过程；同时，锌离子在中枢神经系统（CNS）中还扮演着非常重要的角色。新近研究还表明，锌离子的浓度大小与多种疾病的发生紧密相关[4]。
缺锌对机体有重要影响: 一是对生长发育和组织再生的影响；二是对性器官和性功能的影响；三是锌依赖酶(含锌酶)的活性降低；四是缺锌可使胰岛素降解加剧，引起血中胰岛素水平下降及对葡萄糖利用率减少，葡萄糖耐量下降；五是缺锌可引起血液内视黄醇结合蛋白的浓度降低， 影响组织对维生素A 的利用，使人的暗适应能力下降，还有对皮肤及味觉等的影响[5]。虽然缺锌给人体带来了极大的伤害，但是人体内锌含量的超标也会造成同样大的伤害，如：补锌过量会使人的免疫力下降；可诱发人体的铜缺乏；过量补锌可降低机体内血液、肾和肝内的铁含量，出现小细胞低色素性贫血，红细胞生存期缩短，肝脏及心脏中超氧化物歧化酶等酶活性下降……[6]
因此，若能实时跟踪、监测生物体中的锌离子，就有可能使人们在细胞层次或者组织层次上进行锌离子的生理、生化行为的研究。这对揭开生物体系中锌离子与生物体内许多重要生理、生化功能之间的关系之谜具有极其重要的科学价值。
自1987年第一个锌离子荧光探针(TsQ)诞生以来，陆续研制开发了几种锌离子荧光探针，如Zinquin，Zinpyr-l，ACF-l，ACF-2，NewportGreen等。人类利用这种方便快捷的方式检测Zn2+，为研究生物体内Zn2+的功能和性质以及它的结合方式，探索锌在生物体中的作用做出了卓越的贡献[7]。但在测定生物活体内的游离Zn2+的浓度方面仍存在一定的困难。
2、荧光离子探针识别机理及影响因素
在锌离子的荧光检测中，最关键的是荧光选择性配体的设计。目前报道的荧光选择性配体的基本结构可分为:荧光发色团—间质—识别基团三部分(如图1所示) [4]，其设计大多基于光致电荷迁移(PCT)和电子迁移(PET)两种荧光机理。也有将两种机理结合起来设计的荧光配体。但无论基于何种机理，荧光配体中的荧光发色团和识别基团的选择均极为重要。

图1荧光选择性配体及其对离子识别的工作原理示意图
荧光发色团是构成荧光离子探针的最基本单元，其主要功能是实现识别信息到荧光信号的转换。一般说来，一切具有荧光信号的有机基团都可以作为离子探针的荧光发色团。常用的荧光发色团有以萘，蒽和芘等为主要代表的稠环芳烃类；丹酰基团；以荧光素和罗丹明为代表的呫吨类荧光基团；氟硼二吡咯类；香豆素；1，8-萘酰亚胺等荧光基团(如图2所示) [1]。

图2常用的荧光发色团
间质的作用是将荧光发色团和识别基团连接起来，使之成为一个完整的体系。它以多种形式存在，在很多类型的探针中，起到调节的作用。但是，我们应该知道并非所有的探针都具有间质，一些基于分子内电荷转移机理的探针就没有间质存在[8]。识别基团主要功能在于识别和结合客体，识别基团是荧光离子探针设计中的重中之重，他选择决定了探针分子的选择性和效率。
荧光离子探针的识别性能评价主要受选择性、灵敏性、水溶性、实时性和原位检测性能这五种因素的影响[1]。
选择性主要是指探针分子和识别目标的作用区别于其它因素的情况；灵敏度主要是指探针分子对检测产物的最低检测程度，是灵敏性的表现形式；水溶性是探针分子应用价值的重要基础；实时性主要是指探针分子对检测物的响应速度。响应速度越快说明探针分子的实用性越高，越有利于在实际生活和生产之中应用；原位检测性能则取决于探针分子同被检测体系之间的相容性。相容性越好，则原位检测性能越好。其实在一定限度内，仪器对荧光探针检测的空间分辨率有着重要影响。
3、锌离子荧光探针作用机理
人们先后研究和建立了多种方法用以检测锌离子，如分光光度法，荧光探针法，电离质谱法和核磁共振法等。但是，生物体中的锌大多以络合形式存在分子内和分子间的游离Zn2 + 的浓度很低。近年来，人们已经了解到Zn2 + 的几种传输器的结构、功能以及它的传输形式，但Zn2 + 的吸收、传输、分配及其与蛋白质结合的控制因素还须进一步解释。而进一步了解锌的作用的关键是在一个比较宽的浓度范围内在细胞内和细胞外定量检测锌的流量和水平[10]。
荧光探针法是对锌离子进行定性、定量分析的重要方法，它不仅简便实用，而且在灵敏度、选择性、时间分辨等方面均有突出的优点，所应用的探针应具备以下基本条件：(1) 稳定性高； (2) 对Zn2 + 有高选择性，不受或很少受其它金属离子的干扰；(3) 与Zn2 + 有络合性；(4) 能够快速感光；(5) 容易快速传递到目标体系；(6) 具有实用性。当然，应用在生物体系中还应该有合适的荧光信号性质：( 1) 强荧光； ( 2) 激发波长超过340nm(能穿过玻璃显微镜的目镜并能把由于紫外光对细胞造成的伤害减少到最小)；(3) 与金属离子络合后其发射波长比络合前有> 80nm 的斯托克位移，可消除激发光对荧光测定的干扰等[9]。
目前报道的生物应用锌离子荧光探针按作用机理可分为以下几类：
(1)基于光诱导电子转移(Photoinduced ElectronTransfer PET)的荧光探针；
(2)基于分子内共轭电荷转移(Intramolecular Charge Transfer ICT)的荧光探针；
(3)基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET)的荧光探针；
(4)基于鳌合诱导荧光增强的荧光探针；
(5)化学反应类；
(6) C=N异构化机理。
下面我将对以上的六个作用机理用举例的方式进行描述。
3.1基于光诱导电子转移机理的荧光探针
光诱导电子转移是指发光体(电子给体或受体) 受到光激发后，与接受体(电子给体或受体) 之间的电子转移反应。这种电子转移反应导致发光体的荧光淬灭，但当接受体接受了阳离子后，使接受体丧失了提供或接受电子的能力，从而使发光体的荧光恢复。在这类探针中，荧光团一般作为电子受体，而阳离子接受体(例如:氨基) 作为电子给体[11]。其作用机理如图3所示：

图3基于PET原理的荧光化学传感器模型
6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉(TSQ，1)是第一例用于大脑、心脏及其它组织切片中Zn2 + 浓度检测的荧光探针。TSQ虽然可用于在生理条件下较高浓度的Ca2 + 和Mg2 + 存在时Zn2 + 的检测，但TSQ-Zn2 + 络合物的结构和稳定常数尚不清楚，TSQ/ Zn2 + 可能以1∶1 或2∶1 的形式络合，并且荧光强度在不同的介质中变化较大，所以用TSQ进行定量分析Zn2 + 还有待于进一步研究[10]，另外它的水溶性不好，不适合在活组织中对锌进行测定和成像。为进一步了解TSQ类荧光探针的化学结构，OHalloran小组研究了2-甲基-6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉(2)。结果表明，在中性DMSO/水(50/50)的混合溶液中，2- Zn2 +的络合形式主要是2:1。其中，脱质子的酰亚胺的氮原子及喹啉环上的氮原子与Zn2 +配位[4]。

3.2基于分子内共轭电荷转移的荧光探针
分子内共轭电荷转移类荧光探针的荧光团具有强的推-拉电子体系，电子供给体与接受体共轭相连，在光激发下会产生从电子供给体向接受体的电荷转移。当受体单元与客体结合时，会对荧光团的推-拉电子作用产生影响，或减弱了分子内电荷转移，或强化了电荷转移，从而导致荧光变化；同时，影响荧光团的吸收或发射波长。荧光发射光谱的蓝移或者红移是其主要的变化表现。一般而言，ICT荧光探针也可以导致荧光发射强度增加，但是其效果远远低于PET荧光探针所引起的现象[1]。
如果荧光探针分子的电子给体部分与被检测物结合，就会削弱电子给体部分的推电子能力，降低荧光发色团的电子密度，进而引起吸收光谱的蓝移和摩尔吸光率的降低；如果探针分子电子受体部分同被检测物相结合，那么就会提高受体的拉电子能力，从而导致紫外-可见吸收光谱红移并且伴随这摩尔吸光率的相应变化（如图4[4]）。

图4基于ICT原理的荧光化学传感器模型
Nagan阶绍了两个以ICT为设计原理的Zn2+荧光探针3-[4-N- (N'， N'-二(2-吡啶甲基)2-氨乙基)胺-5-甲氧基]-苯并呋喃基-1，3-氧氮杂茂-4-羧酸ZnAF-R1和ZnAF-R2。ZnAF-R2的水溶性和荧光量子产率都强于ZnAF-R1，也更适合于在生物体系中检测Zn2+。在Ph=7.4，100mmol的HEPES缓冲液中，对于ZnAF-R2，随着Zn2+的加入直至饱和，荧光量子产率从0.17降到0.1，最大激发波长从365nm蓝移到335nm，而ZnAF-R2荧光强度的比 (335nm/365nm)不断增大，通过这种比值可计算出Zn2+的浓度。生物体中的一些高浓度的金属离子(如Na+、K+、Ca2+、Mg2+等)都不会对ZnAF-RS的荧光产生影响。Cd2+和Zn2+一样可以使ZnAF-RS的激发光谱蓝移，Cu2+、Co2+和ZnAF-RS形成络合物并强烈地淬灭它的荧光。但它们在生物体的浓度非常小，影响甚微。ZnAF-RS对Zn2+的检测极限在纳摩尔范围，其灵敏度适用于哺乳细胞[1]。
3.3基于荧光共振能量转移的荧光探针
荧光共振能量转移是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程（如图5），当一个荧光分子(又称为DONOR)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为ACCEPTOR)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。

图5荧光共振能量转移机理
以1为例，肽连接在两个荧光染料之间，荧光素作为能量给体，丽斯胺作为能量受体。在没有结合Zn2 +之前，肽打开，两个染料距离相对较远，分子内能量转移极弱。当Zn2 + 结合到Cys2/His2 后，肽折叠起来使两个染料距离拉近，增大了分子内的能量转移，pH=7.1时，结合了Zn2 + 后的1在596nm 处(激发波长为430nm) 荧光强度增大213 倍。但是，1与Zn2 +也是以1∶1 或2∶1 络合，并且这种络合必须在一种还原性条件下进行以防止肽的氧化。另外还报道了一些其它类型的Zn2 + 荧光探针，它们在生物体中的实际应用价值都不高。

3.4基于鳌合诱导荧光增强的荧光探针
大多数荧光物质都具有芳香环或杂环，其π电子的非定域性越大，就越容易被激发，分子的荧光效率越大。因此，凡能提高π电子共扼程度的结构，如对-苯基化、间-苯基化、乙烯化的作用都会增大荧光的强度。进一步研究发现，探针分子的结构，如分子骨架的刚柔性，对分子的荧光强度有重要影响。当分子结构趋平面化，空间扭转能力降低都可以使荧光增强。另外，当探针分子与金属离子配合后，分子的骨架刚性增加，使上述各种电子或能量转移受到影响，因此引起荧光增强。目前已报道了许多基于这种鳌合诱导荧光增强的Zn2+荧光探针。(图6)[12]

图6 Schematic representation of modular Zn2+-binding peptides. Totune the KD for Zn2+，the â-turn sequence，additional Zn2+ ligand，and theligand arrangement are altered.
从图中可以看出随着锌的浓度的增加，鳌合诱导荧光增强，从而实现对锌离子的检测。
3.5化学反应类
化学反应类探针分子是识别基团和荧光发色团合二为一的体系。它和检测物进行特异性化学反应或者在其诱导下自身发生化学反应导致荧光发色团的结构改变，而产生相应的荧光发射光谱性质变化，进而达到检测的目的。此类型主要有荧光素结构开闭环类以及其他类别，有关文献报道了通过化学反应来改变分子探针的结构而实现发光[13](如图7所示)。

图7通过化学反应实现对锌离子的检测
3.6 C=N异构化机理
C=N异构化机理是指利用C=N异构化来致使与其相连的荧光发色团荧光减弱甚至消失，当被检测物与C=N相互作用打破其顺-反结构体的互变，使其固定，从而引起荧光强度地恢复，实现检测。以此机理为指导，已有部分工作展[14]，文章指出此类反应可能的结构机理(图8)，此类工作还在进一步的研究中。

图8 M=Cu、Zn、Ni
纵观这几类荧光探针对锌的作用机理，其中研究比较多的是PET和ICT机理，首先这两个机理研究的比较早有大量的相应的理论及试验数据等支撑，从而使得人们对这两个的研究更加的深入，相对来说这两个机理的研究也是比较容易的而且也有很多商品化了的检测锌的荧光分子探针，但是还有很多的不足之处，仍需要改进与提高。而后几种机理的研究就不是那么的突出，只有一些文献报道，这些也是另一些机理的探讨与新路线的开发，相信随着研究的不但深入会有越来越多的成果。
关于生物应用Zn2 + 荧光探针的研究近年来发展很快，并且也得到了一些性能良好的探针。其中几个荧光素类生物传感器，是通过DPA 与Zn2 +络合后荧光强度的增大来检测Zn2 + 的存在。另外一些是丹磺酰胺在中性pH 脱质子后结合Zn2 + 发出强烈的荧光。有文献介绍了在过去的50年中的几十种Zn2 + 荧光探针。这些芳香分子都能够在溶液中以络合形式某种程度上结合游离Zn2 +导致荧光增强。但是，只有少数在生物体系中被证明有用。主要有以下几条原因：（1）在生物体系中有富足的Mg2 + (一般在细胞内和细胞外都达到2mmol ) 和Ca2 + ( 细胞外3mmol 和细胞内10nmol～1μmol) ，它们会潜在的干扰对Zn2 +的检测；（2）对Zn2 + 的敏感性不够高；（3）必须能够准确地将探针荧光强度的变化与待分析物的浓度关联起来……
4、锌离子荧光探针的合成设计展望
综上所述，人类在应用荧光法测定游离的Zn2 +方面已经取得了很大的进步，但在测定生物活体内的游离Zn2 +的浓度方面仍需进一步的研究，要想研究Zn2 +的功能和性质以及它在生物体内的结合方式，都需要有一种方便快捷的方式跟踪Zn2 +，荧光探针法正符合这种需求，它是利用一种特异的荧光试剂去标记活体内的Zn2 +，借以发现和研究生物体内Zn2 +的位置、结构和功能。
因此，各国致力于研究Zn2 +的科研工作者都在力求研究出一种与Zn2 +具有高特异性结合的物质，这种物质应具有：①配位易得且配位能力强；②能在生理pH范围检测毫微摩尔浓度Zn2 +；③Zn2 +在荧光敏感方面具有高选择性，其它金属离子的荧光干扰极小或者非常有限或者可以掩蔽；④Zn2 +作用敏感且反应速度快；⑤良好的细胞渗透性，并使其在不伤害活体细胞的情况下发出荧光；⑥荧光效率高等特点。一旦有了这把钥匙，许多生物体之谜就会迎刃而解。
虽然人们已经研究出不少的检测锌的荧光分子探针，但是仍然需要寻找新的荧光团和识别配体，以便研究更适合生物应用的Zn2 + 荧光探针来真正达到对生物体中Zn2 + 的定量分析。

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