DB6111∕T+133-2019++谷子杂交种快速鉴定技术规范.docx
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1、ICS 65.020.9 B61DB6111杨凌农业高新技术产业示范区地方标准DB 611/T132019谷子杂种快速鉴定技术规范Technical Specification for Rapid Identification of Foxtail Millet Hybrids2019-08-15发布2019-09-01实施杨凌示范区市场监督管理局发 布DB611/T132019前言本规范依据GB/T1.1-209给出的规定起草。本规范由杨凌示范区农业标准化技术委员会提出并归口。本规范起草单位:西北农林科技大学。本规范主要起草人:冯佰利、袁雨豪、杨璞、高小丽、王鹏科、高金锋、宋慧、梁鸡保。有关
2、专利的说明按照GB/T1.1-209中附录C进行。本规范首次发布。IDB611/T132019谷子杂种快速鉴定技术规范1 范围本规范规定了谷子杂种快速鉴定的术语和定义、鉴定步骤及鉴定结果汇总。本规范适用于谷子F1代杂合单株的鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T8232 粟(谷子)GB/T3098 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法3 术语和定义3.1亲本 Parentslines杂交育种中所选用的雌雄性个体。3.2杂种 F1Hybrid
3、F1采用温汤杀雄、阳光杀雄或人工去雄等方法去雄后授粉,获得的F1种子。3.3SR标记 SimpleSequenceRepeatsmarker一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术,是一类由几个核苷酸(一般为16个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。4 鉴定步骤4.1 基因组 DNA提取选取符合GB/T8282的谷子杂交种,参照GB/T3098提取基因组DNA,用超微量分光光度仪测定DNA含量,用ddH2O稀释到所需工作浓度(30ng/L)。试验所用试剂见附录A。4.2 PCR扩增反应体系和程序1下列术语和定义适用于本文件。4.2.1 扩增体系反应总体积10L,其中模板DNA样品
4、(30ng/L)2L,10PCRbufer(Mg2+)1L,dNTPs(2.5 mol/L)1L,PrimerF(10mol/L)0.5L,PrimerR(10mol/L)0.5L,TaqE(5U/L)0.1L。试验所用试剂见附录A。4.2.2 反应程序将反应体系混匀后进行PCR扩增:95预变性3min,95变性30s,5065退火45s,72延伸1min,共35个循环,72延伸10min,16保存。将扩增后的PCR产物加入2L非变性6Loading bufer,混合均匀,短时间内置于4保存,长时间内置于-20保存备用。扩增产物用8%聚丙烯酰胺检测。4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测4.3.1 制
5、胶洗涤:将A、B板洗涤至清水无阻力流下,竖立晾干。封底:每板15ml8%聚丙烯酰胺,加入150L10%过硫酸铵和15L四甲基乙二胺,聚合1min。分离胶:每板25ml8%聚丙烯酰胺,加入10 L10%过硫酸铵和50L四甲基乙二胺,聚合1h。待凝胶1h后,将与6Loadingbufer混合后的PCR扩增产物每个点样孔加入3L。电泳缓冲液为1TBE,150V180V恒压条件下电泳1.5h2h。4.3.3 银染固定:将完成电泳的胶块放入固定液中,振摇12min以上。 银染:固定完成后,倒出固定液,加入银染液,振摇12min。脱色:银染完成后,倒出银染液,加入ddH2O,振摇1min。显影:脱色完成后
6、,倒出ddH2O,加入30 mL现配的显影液,待谱带清晰(以Marker为准)后照相并记录带型。4.3.4 亲本间多态性 SR标记筛选用附录B中的SSR引物进行PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,筛选出亲本间差异性标记。结果 记录见表1。表1 亲本间多态性引物记4.3.5 F1杂合性鉴定用亲本间存在差异的标记,对相应F1进行单株检测。同时具有父母本的条带或只具有父本条带的为真杂种;仅具有母本条带的为假杂种。结果记录见表2。24.3.2 电泳引物编号所在染色体位置多态性引物位点数表2 F1多态性检测结果记载表杂交组合号母本父本SSR 引物组合F1 基因型5 鉴定结果汇总所有鉴定数据、表格、图片
7、整理后归档保存。保存F1真杂种及对应的亲本组合。3附 录 A(资料性附录) 实验相关试剂A.1 实验相关试剂A.1.1 10%CTAB溶液的配置称取10gCTAB加入80mLdH2O,置于65C水浴锅内加热至溶解,用ddH2O定容至10 mL。A.1.2 1mol/LTris-HCl溶液的配置称取12.14gTris,溶于80mLdH2O中,用浓盐酸约50 l调节pH至8.0,用ddH2O定容至10 mL。A.1.3 0.5mol/LEDTA溶液的配置称取14.615gEDTA,加入80mLdH2O,加入约7g固体氢氧化钠,边加边搅拌,调节pH至8.0,用 dH2O定容至10 mL。A.1.4
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