免疫学实验二elisa双抗夹心法.pptx

免疫学实验二免疫学实验二elisaelisa双抗夹心法双抗夹心法免疫学实验二elisa双抗夹心法第1页酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）是将抗原、抗体特异性反应与酶对底物）是将抗原、抗体特异性反应与酶对底物高效催化作用相结合一个敏感性很高试验技术，可用于检测体液中微量高效催化作用相结合一个敏感性很高试验技术，可用于检测体液中微量特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体特异性反应在一个固相载体表面特异性抗体或抗原。首先，抗原、抗体特异性反应在一个固相载体表面聚苯乙烯微量反应板孔中进行，经过洗涤去除多出游离反应物；然后聚苯乙烯微量反应板孔中进行，经过洗涤去除多出游离反应物；然后加入酶标识抗体或酶标识抗抗体，从而形成抗体抗原酶标抗体复合加入酶标识抗体或酶标识抗抗体，从而形成抗体抗原酶标抗体复合物（双抗体夹心法）或抗原抗体抗抗体复合物（间接法）；此时加物（双抗体夹心法）或抗原抗体抗抗体复合物（间接法）；此时加入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体展现显色反应。液体显色强入酶底物和显色剂，在酶催化底物后，液体展现显色反应。液体显色强弱与复合物中待测抗原或抗体量呈正比，借此可检测待测抗原或抗体有弱与复合物中待测抗原或抗体量呈正比，借此可检测待测抗原或抗体有没有及含量。没有及含量。该技术特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果轻易观察。该技术特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果轻易观察。试验原理：试验原理：免疫学实验二elisa双抗夹心法第2页免疫酶技术是利用酶标识抗体或抗原，以检测免疫酶技术是利用酶标识抗体或抗原，以检测对应抗原或抗体一个免疫学标识技术。其原理对应抗原或抗体一个免疫学标识技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原特异性及免疫反应性，也不影响酶催化效能。特异性及免疫反应性，也不影响酶催化效能。当存在对应酶底物时，酶能催化产生有颜色产当存在对应酶底物时，酶能催化产生有颜色产物，颜色有没有及深浅能反应对应抗原或抗体物，颜色有没有及深浅能反应对应抗原或抗体是否存在及其量多少。是否存在及其量多少。试验原理：试验原理：免疫学实验二elisa双抗夹心法第3页ELISA测定方法包含：测定方法包含：双抗体夹心法：检测抗原最常见方法双抗体夹心法：检测抗原最常见方法间接法：检测抗体最常见方法间接法：检测抗体最常见方法竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体生物素亲和素系统生物素亲和素系统ELISA法：是在法：是在ELISA中引入生物素或亲中引入生物素或亲和素放大系统，检测极微量抗原或抗体方法。和素放大系统，检测极微量抗原或抗体方法。免疫学实验二elisa双抗夹心法第4页直接法直接法间接法间接法免疫学实验二elisa双抗夹心法第5页免疫学实验二elisa双抗夹心法第6页BAS-ELISA 底物底物1.已知已知Ab包被固相包被固相2.加待检标本加待检标本3.加生物素标识特异性抗体加生物素标识特异性抗体4.加酶标识亲和素加酶标识亲和素5.加底物显色加底物显色亲和素亲和素酶酶生物素生物素待检标本待检标本biotin-avidin-system，生物素，生物素-亲和素系统亲和素系统此法敏感性更高。用于抗原抗体以及此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA检测。检测。免疫学实验二elisa双抗夹心法第7页材料和试剂：材料和试剂：1.HBsAg、包被液。、包被液。2.待检人血清。待检人血清。3.酶标识抗酶标识抗HBsAb抗体。抗体。4.HBsAb阳性对照血清、阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清阴性对照血清5.洗涤液：洗涤液：PH7.40.01mol/L PBS-吐温吐温20。6.底物溶液：底物溶液：OPD-H2O2或或TMD-H2O2。7.终止液：终止液：2mol/L H2SO4。8.酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪 酶酶标标板板移移液液器器酶标仪酶标仪免疫学实验二elisa双抗夹心法第8页操作步骤：1.包被包被：将：将HBsAg用包被液作适当稀释（用包被液作适当稀释（1：100），在），在96孔反应板中每孔加孔反应板中每孔加100l，置，置372h后再移置后再移置4过过夜。夜。2.洗涤：将洗涤：将96孔反应板倾去包被液，用洗涤液孔反应板倾去包被液，用洗涤液PBS-吐温吐温20加满各孔，置加满各孔，置3min,倾去，如此重复倾去，如此重复3次。（前两步次。（前两步已完成已完成）免疫学实验二elisa双抗夹心法第9页1.1.已知抗原包被酶标板已知抗原包被酶标板2.12.1弃去板内包被抗原弃去板内包被抗原2.22.2拍干拍干2.32.3加满洗涤液（重复三次）加满洗涤液（重复三次）免疫学实验二elisa双抗夹心法第10页3.3.加样加样（1）阳性对照阳性对照：第：第1、2孔加孔加HBsAb阳性对照血清阳性对照血清50l；（2）阴性对照阴性对照：第：第3、4孔加孔加HBsAb阴性对照血清阴性对照血清50l；（3）空白对照空白对照：第：第5孔加生理盐孔加生理盐水水100l；（4）余下各孔加）余下各孔加待检血清待检血清50l。免疫学实验二elisa双抗夹心法第11页4.加加酶标识抗酶标识抗HBsAb抗体抗体：除空白对照外除空白对照外各孔各孔50l，充分混，充分混匀。将即时帖覆盖于反应板上，匀。将即时帖覆盖于反应板上，37孵育孵育30min。5.弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置弃去反应孔内液体，拍干，用洗涤液注满各孔、静置30秒、秒、再拍干，重复洗涤再拍干，重复洗涤5 次。次。(操作同操作同2)6.显色显色：各孔（包含空白对照）加底物：各孔（包含空白对照）加底物A液液50l（1滴），底滴），底物物B液液50l（1滴），置滴），置37避光温育避光温育15min。7.终止反应终止反应：各孔加终止液：各孔加终止液50l（2mol/L H2SO4）。）。8.比色比色：将反应板以酶标仪：将反应板以酶标仪450nm处用空白孔调零，测各孔处用空白孔调零，测各孔OD值。值。免疫学实验二elisa双抗夹心法第12页6.显色显色各孔（包含空白对照）加底物各孔（包含空白对照）加底物A液液50l（1滴），底物滴），底物B液液50l（1滴），置滴），置37避光温育避光温育15min7.终止反应终止反应各孔加终止液各孔加终止液50l（2mol/L H2SO4）免疫学实验二elisa双抗夹心法第13页OPD（邻苯二胺）经酶（邻苯二胺）经酶作用后显色反应作用后显色反应终终止止前前终终止止后后TMB四甲基联苯胺经酶作四甲基联苯胺经酶作用后显色反应用后显色反应终终止止前前终终止止后后免疫学实验二elisa双抗夹心法第14页结果判断：u计算：计算：判断值阴性对照平均判断值阴性对照平均OD值值2.1u结果判断：待测样品孔结果判断：待测样品孔OD值值大于或等于判断值为阳性大于或等于判断值为阳性；小于判断值为阴性小于判断值为阴性。注：阴性对照注：阴性对照OD值小于值小于0.05按按0.05计算，计算，大于大于0.05按实际按实际OD值计算判断值。值计算判断值。免疫学实验二elisa双抗夹心法第15页注意事项：1.试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀，弃去弃去12滴垂直滴加；滴垂直滴加；2.严格按照操作程序依次加样，以确保试验结果准确性；严格按照操作程序依次加样，以确保试验结果准确性；3.应尽可能防止孔中有气泡，以免所测得应尽可能防止孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。值不准确。免疫学实验二elisa双抗夹心法第16页思索题：1.免疫标识技术有哪些？各有何特点？。2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？免疫学实验二elisa双抗夹心法第17页免疫学实验二elisa双抗夹心法第18页级医疗专科复习题一、名词解释一、名词解释2.5*8,2.5*8,共共2020分分 免疫、抗原、抗原决定基免疫、抗原、抗原决定基(表位表位)、异嗜性抗原、白细、异嗜性抗原、白细胞分化抗原、胞分化抗原、TD-AgTD-Ag、TI-AgTI-Ag、抗体抗体、免疫球蛋白免疫球蛋白、单（多）单（多）克隆抗体克隆抗体、补体补体、经典路径、旁路路径、经典路径、旁路路径、细胞因子细胞因子、ILIL、IFNIFN、CSFCSF、TNFTNF、MHCMHC、MHCMHC限制性、限制性、TCRTCR、BCRBCR、模式识别受体模式识别受体（PRRPRR）、抗原提呈细胞）、抗原提呈细胞（APCAPC）、适应性免疫应答、免疫耐）、适应性免疫应答、免疫耐受、免疫调整、受、免疫调整、超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、超敏反应、人工主动免疫、人工被动免疫、计划免疫计划免疫注：红色标识为要求掌握英文免疫学实验二elisa双抗夹心法第19页二、填空题（二、填空题（0.540=200.540=20分）分）三、单项选择题（三、单项选择题（130=30130=30分）分）免疫学实验二elisa双抗夹心法第20页1.1.免疫三大功效及其生理和病理表现。免疫三大功效及其生理和病理表现。2.2.影响抗原免疫原性原因。影响抗原免疫原性原因。3.3.医学上有哪些主要抗原。医学上有哪些主要抗原。4.4.简述简述IgIg基础结构。基础结构。5.5.免疫球蛋白有哪些主要生物学功效？免疫球蛋白有哪些主要生物学功效？6.6.简述补体组成。简述补体组成。7.7.补体活化三条路径比较。补体活化三条路径比较。8.8.补体有哪些主要生物学功效？补体有哪些主要生物学功效？9.9.细胞因子有哪些共同特征？细胞因子有哪些共同特征？10.10.细胞因子主要生物学作用。细胞因子主要生物学作用。简答简答52=10免疫学实验二elisa双抗夹心法第21页11.11.简述简述MHCMHC分子结构及其分布。分子结构及其分布。12.12.HLAHLA主要生物学功效。主要生物学功效。13.13.T T细胞表面有哪些与其功效相关主要分子。细胞表面有哪些与其功效相关主要分子。14.14.B B细胞表面有哪些与其功效相关主要分子。细胞表面有哪些与其功效相关主要分子。15.15.巨噬细胞主要生物学功效。巨噬细胞主要生物学功效。16.16.简述免疫应答基础过程。简述免疫应答基础过程。17.17.抗原提呈路径（两条）。抗原提呈路径（两条）。18.18.固有免疫组成及其与适应性免疫关系。固有免疫组成及其与适应性免疫关系。19.19.两种人工免疫主要区分。预防接种注意事项。两种人工免疫主要区分。预防接种注意事项。20.20.灭活疫苗与减毒活疫苗主要区分。灭活疫苗与减毒活疫苗主要区分。免疫学实验二elisa双抗夹心法第22页叙述题（叙述题（102=20）免疫应答：免疫应答：如如TDTD抗原诱导体液免疫应答过程；抗原诱导体液免疫应答过程；TDTD抗原诱导细胞免疫应答过程。抗原诱导细胞免疫应答过程。超敏反应：超敏反应：四个型别超敏反应发生机制及相关防治标准，四个型别超敏反应发生机制及相关防治标准，主要在主要在1 1和和2 2型。型。免疫学实验二elisa双抗夹心法第23页