农业大学病毒学实验技术之病毒纯化.pptx
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1、第六章第六章 病毒纯化病毒纯化 利用各种物理、化学方法,以利用各种物理、化学方法,以不使不使病毒受损伤和失活为前提病毒受损伤和失活为前提,去除宿主细,去除宿主细胞组分等非病毒杂质,提取出高纯度浓胞组分等非病毒杂质,提取出高纯度浓缩病毒样品。缩病毒样品。病毒微细结构研究病毒微细结构研究病毒抗原蛋白分离纯化病毒抗原蛋白分离纯化病毒化学成份及其遗传物质研究病毒化学成份及其遗传物质研究病毒感染分子细节研究病毒感染分子细节研究农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第1页一、病毒纯化标准一、病毒纯化标准保持感染性保持感染性含有均一性:含有均一性:结晶形成结晶形成检测病毒制备物均一性方法:检测病毒制备物均一性方法
2、:电镜观察:电镜观察:大小、形态均一大小、形态均一超速离心:超速离心:沉降速率和密度一致,只出现一条沉降带沉降速率和密度一致,只出现一条沉降带电泳:电泳:颗粒大小及表面电荷均一,只形成一条电泳带颗粒大小及表面电荷均一,只形成一条电泳带免疫学方法:免疫学方法:只与特异性抗体发生反应只与特异性抗体发生反应大小、形态、密度、化学组成、大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性分子量、抗原性农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第2页二、病毒纯化理论依据二、病毒纯化理论依据病病毒毒体体外外表表面面主主要要化化学学组组成成是是蛋蛋白白质质,可可利利用蛋白质提纯方法纯化病毒用蛋白质提纯方法纯化病毒病病毒毒体体含
3、含有有一一定定大大小小、形形状状和和密密度度,可可利利用用超速离心技术提纯病毒超速离心技术提纯病毒农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第3页三、病毒纯化前预处理三、病毒纯化前预处理1 1、病毒感染组织、脏器或细胞、病毒感染组织、脏器或细胞 研磨匀浆研磨匀浆超声波处理超声波处理重复冻融重复冻融低速离心去掉细胞碎片低速离心去掉细胞碎片2 2、细胞培养液、鸡胚尿囊液、细胞培养液、鸡胚尿囊液 低速离心去掉可能含有杂质或直接用于低速离心去掉可能含有杂质或直接用于病毒分离纯化病毒分离纯化农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第4页沉淀法沉淀法超速离心法超速离心法超滤法超滤法层析法层析法两相溶剂间分配系数法两相溶剂间
4、分配系数法吸附法吸附法电泳法电泳法四、病毒纯化方法四、病毒纯化方法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第5页(一)沉淀法(一)沉淀法 主要从稀病毒悬浮液中浓缩病毒。主要从稀病毒悬浮液中浓缩病毒。中性盐沉淀法(盐析)中性盐沉淀法(盐析)聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法皂土法皂土法鱼精蛋白沉淀法鱼精蛋白沉淀法农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第6页1 1、中性盐沉淀法(盐析)、中性盐沉淀法(盐析)先用其它方法去除材料中大量杂质,再以先用其它方法去除材料中大量杂质,再以高浓度中性盐溶液盐析,析出沉淀用缓冲液悬高浓度中性盐溶液盐析,析出沉淀用缓冲液悬浮后再进行
5、盐析,重复几次后,悬浮沉淀,用浮后再进行盐析,重复几次后,悬浮沉淀,用透析法或其它方法脱盐。透析法或其它方法脱盐。病毒普通在病毒普通在45%45%以上饱和度硫酸铵溶液中沉以上饱和度硫酸铵溶液中沉淀,且保持感染性。淀,且保持感染性。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第7页2 2、聚乙二醇(、聚乙二醇(PEGPEG)沉淀法)沉淀法 用于病毒沉淀分子量:用于病毒沉淀分子量:-6000 -6000 将将PEGPEG配配成成50%50%左左右右溶溶液液,或或直直接接将将固固体体PEGPEG加加于于病病毒毒悬悬液液中中,使使其其到到达达所所需需浓浓度度,在在44搅搅拌拌过过夜,然后离心使病毒沉淀。夜,然后离
6、心使病毒沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第8页3 3、有机溶剂沉淀法、有机溶剂沉淀法 乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物原理:原理:A A、降低溶液介电常数,从而增加病毒颗粒、降低溶液介电常数,从而增加病毒颗粒表面不一样电荷之间引力,造成其溶解度降表面不一样电荷之间引力,造成其溶解度降低。低。B B、与水作用,破坏蛋白质分子水化膜。、与水作用,破坏蛋白质分子水化膜。优点:优点:分辨力高,易除去分辨力高,易除去缺点:缺点:易使表面蛋白质变性,溶解脂质易使表面蛋白质变性,溶解脂质农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第9页4 4、等电点沉淀法(分辨力不高)、等
7、电点沉淀法(分辨力不高)原理:原理:病毒粒子在等电点时,所携带正电荷与负病毒粒子在等电点时,所携带正电荷与负电荷相互中和,因而失去相互排斥作用而发生沉电荷相互中和,因而失去相互排斥作用而发生沉淀(分辨力不高)。淀(分辨力不高)。多数病毒等电点在多数病毒等电点在pH4.pH4.5.55.5之间。之间。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第10页5 5、皂土法、皂土法 轮状病毒轮状病毒 皂土在酸性条件下(皂土在酸性条件下(pH4pH44.5)4.5)可吸附轮状病可吸附轮状病毒,在碱性条件下毒,在碱性条件下(pH8.5)(pH8.5),又使其洗脱下来。,又使其洗脱下来。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第
8、11页6 6、鱼精蛋白沉淀法(沉淀直径大于、鱼精蛋白沉淀法(沉淀直径大于50nm50nm病毒)病毒)鱼精蛋白为碱性蛋白,含有携带其它蛋白质(直鱼精蛋白为碱性蛋白,含有携带其它蛋白质(直径大于径大于50nm 50nm)共沉淀作用,当向这种沉淀物加入)共沉淀作用,当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl1mol/L NaCl时,其它蛋白质又重新释放到悬液中,时,其它蛋白质又重新释放到悬液中,而鱼精蛋白依然沉淀。而鱼精蛋白依然沉淀。农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第12页(二)层析法(二)层析法葡聚糖柱层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法凝胶层析法离子交换柱层析法离子交换柱层析法亲和层析法亲和层析法 农业
9、大学病毒学实验技术之病毒纯化第13页(三)两相溶剂间分配系数法(三)两相溶剂间分配系数法原理:原理:溶质在两个互不相溶溶剂中分配系数不一样而溶质在两个互不相溶溶剂中分配系数不一样而选择性地分配于其中一方。选择性地分配于其中一方。惯用溶剂:惯用溶剂:葡聚糖硫酸盐(葡聚糖硫酸盐(dextran sulphate,Ds)dextran sulphate,Ds)聚乙二醇(聚乙二醇(PEGPEG)甲基纤维素(甲基纤维素(MCMC)聚乙烯醇(聚乙烯醇(PVAPVA)分配体系:分配体系:Ds-PEGDs-PEG系、系、Ds-PVADs-PVA系、系、Ds-MCDs-MC系系农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第
10、14页(四)吸附法(四)吸附法原理:原理:利用对病毒或对杂质有选择吸附能力固体利用对病毒或对杂质有选择吸附能力固体吸附剂吸附病毒或吸附杂质,再用一定盐溶液把吸附剂吸附病毒或吸附杂质,再用一定盐溶液把它们洗脱下来。它们洗脱下来。作为吸附剂必须具备特点:作为吸附剂必须具备特点:有较大表面积和吸附能力有较大表面积和吸附能力较高吸附选择性较高吸附选择性便于洗脱便于洗脱性质稳定性质稳定农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第15页惯用吸附剂:惯用吸附剂:白土白土磷酸钙磷酸钙硅藻土硅藻土红细胞红细胞离子交换树脂离子交换树脂羧甲基纤维素羧甲基纤维素农业大学病毒学实验技术之病毒纯化第16页(六)超滤法(六)超滤法
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