抗血管新生研究进展.doc

张清媛教授：抗肿瘤血管生成治疗研究进展
上世纪七十年代，Folkman 在《新英格兰医学杂志》中首次提出了肿瘤生长依赖于新血管生成的理论假说，随着 8 年后毛细血管内皮细胞培养技术的建立，11 年后第一个血管生成抑制剂的发现，13 年后第一个血管生成活性蛋白的纯化等，这一观点为越来越多的证据所支持，并逐渐使这一领域成为肿瘤研究的热点。

　　肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过 1~2 mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。与传统的抗癌治疗相比，抗血管生成治疗具有许多优点：(1)正常成年人的血管形成基本停止，内皮细胞常处于不分裂状态，只有在妊娠、月经周期、炎症、外伤和肿瘤等特殊情况，血管形成才被启动，因此，抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大，具有良好的特异性；(2)血管内皮细胞暴露在血液中，药物能够直接发挥作用，无需渗透 Endostatin，所用药物剂量小、疗效高；(3)血管内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药；(4)作用具有放大效应，因为一个内皮细胞支持 50~100个肿瘤细胞生长。因此，在过去的 30 多年中，人们一直在努力寻找合适的靶点以阻断和破坏肿瘤血管生成，研制有效的抗肿瘤血管生成药物，近年来取得了许多令人鼓舞的成绩。

　　一、肿瘤血管生成的机理

　　Folkman 曾提出在肿瘤发生和发展过程中的存在"血管生成开关机制"，揭示了肿瘤微血管形成的分子机制。在肿瘤生长的最初阶段，并不是所有的实体瘤都具备血管生成表型，但随着肿瘤细胞不断分裂增殖，那些伴有癌基因或抑癌基因突变并具备了血管生成表型的肿瘤细胞逐渐增殖形成优势，它们通过多个途径诱导周围组织新生血管形成。这些途径可分为以下几种：(1)肿瘤细胞癌基因的表达或抑癌基因的失活，可使肿瘤细胞获得血管生成表型，诱导局部新血管形成；(2)肿瘤细胞产生的各种趋化因子使单个核细胞浸润到肿瘤组织内，它们释放的促新生血管生长因子和多种蛋白酶有助于新生血管形成；(3)肿瘤生长到一定程度其内部处于明显低氧状态，低氧可使肿瘤血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达明显增加，并以旁分泌的方式诱导新生血管生成；(4)内皮细胞通过自分泌途径加速新生血管的形成。

　　肿瘤血管生成过程中涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡。这一过程不仅涉及促血管生成因子分泌增加，而且内源性血管生成抑制因子产生相应减少。目前已分离和纯化了 20 多种血管生成因子和 10 多种血管生成抑制因子。血管生成因子主要包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、血管生成素(angiogenin)、胎盘生长因子(PIGF)、白介素-8、肿瘤坏死因子 α(TNFα)等。内源性血管生成抑制因子主要包括血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、凝血酶敏感蛋白(TSP-1)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、血小板因子 4(PF4)、干扰素 α(IFN-α)、白介素-10(IL-10)、可溶性 VEGF 受体(sFlt-1)、可溶性酪氨酸激酶受体(sTie-2)等。

　　VEGF 是一种有生物学效应的血管源性肽，它能够调整造血干细胞的发育、细胞外基质的改型和炎性细胞因子的产生。VEGF 有 3 个高亲合性的酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为 VEGFR-1/Flt-1 、VEGFR-2/KDR/Flk-1 和 VEGFR3/Flt-4。KDR 是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关； F1t-l 主要在内皮细胞排列形成管腔时发挥作用，因这两种受体主要表达在内皮细胞上，虽然极少数造血细胞、单核细胞也少量表达，但只有内皮细胞对 VEGF 有应答反应，故 VEGF 是一个特异作用于血管内皮细胞的生长因子。VEGF 及其受体通过旁分泌途径联合调控内皮细胞分化及血管形成。VEGF 家族目前主要包括 VEGF(VEGF-A)、胎盘生长因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 和 VEGF-E，其中 VEGF 是诱导肿瘤血管形成作用最强、特异性最高的血管生长因子。VEGF 是抗肿瘤血管形成治疗和抗肿瘤转移治疗较为理想的靶点，抑制 VEGF 介导的血管生成的方法包括：针对VEGF 或其受体(VEGFRs) 的抗体、可溶性受体，VEGFRs 酪氨酸激酶的小分子抑制剂以及利用 VEGF 的突变异二聚体封闭其受体结合位点等。

　　FGF 是一种细胞丝裂原促血管生长因子，在许多肿瘤中起着重要的作用。它包括酸性成纤维细胞生长因子 aFGF 和碱性成纤维细胞生长因子 bFGF。bFGF 在血管生成中的作用尤其突出，bFGF 是血管内皮细胞中很强的促分裂因子和趋化因子，以旁分泌及自分泌的形式产生，通过和不同的内皮细胞表面受体结合激活其血管原性，bFGF 还可通过激活 PI3K/Akt 信号传导途径，抑制内皮细胞的凋亡，促进血管形成。bFGF 也可以趋化血管内膜的多种细胞，并诱导这些细胞表达蛋白水解酶、胶原酶等，这些酶具有促进内皮细胞增殖、迁移，降解细胞外基质蛋白的能力，诱导血管生成。

　　血管生成抑制因子研究较多的是 Endostatin，Endostatin 是 XV 型胶原的梭基末端片段，是一种特异的血管生成抑制因子。Endostatin 能作用于 VEGF 的受体 KDR/Flk-1，阻止 VEGF 与内皮细胞结合，直接阻断 VEGF。除了直接作用外，它还可以与 bFGF 竞争结合，下调 VEGF mRNA 和蛋白表达，阻断VEGF 受体的信号转导，从而抑制 VEGF 介导的内皮细胞迁移和血管生成。

　　上述血管生成调节因子是肿瘤血管治疗的重要靶分子，我们可以通过阻断血管生成促进因子的作用途径或增强血管生成抑制因子的活性来达到治疗肿瘤的目的。

　　二、抗血管生成药物的研究策略

　　以血管生成的各个环节及其发生过程中的生化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，将成为肿瘤防治的一个重要途径。总体来说，血管生成抑制剂的研究主要有以下几种策略；(1)阻断血管生成因子的合成和释放，或拮抗其作用，如 VEGF 单抗 Avastin、Endostatin、IFN-α2a、SU5416 等；(2)阻断内皮细胞降解周围基质的能力，如基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂， Marimastat、AG3340、Neovastat等；(3)直接抑制内皮细胞的功能，如 Thalidomide、TNP-470、Squalamine 等；(4)阻断内皮细胞表面整和素的作用，如 Vitaxin、EMD121974 等。另外，还有一些非特异性作用机制的血管生成抑制剂，如 CLA、IL-12、IM862 等。目前应用于临床的药物主要有贝伐单抗、恩度和反应停等。现期进入临床的一些分子靶向药物，如多靶点酶抑制剂索拉非尼、苏尼替尼和范得他尼，以及酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和埃罗替尼，也可阻断血管生成相关的信号途径，发挥抑制肿瘤新生血管的作用。

　　三、靶向肿瘤血管生成药物的治疗研究

　　(一) 单克隆抗体

　　1.贝伐单抗(Avastin，阿瓦斯汀)

　　罗氏公司研发的贝伐单抗(Avastin)是一种抗 VEGF 的人源化抗体( IgG1)， 93%的人源结构域和 7%由的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004 年 2 月得到美国食品和药品管理局(FDA)的批准。Avastin 联合 5- 氟尿嘧啶为基础的化疗用于一线治疗晚期结直肠癌患者，明显延长患者生存期。2005 年美国 ASCO 评出贝伐单抗提高大肠癌生存率和非小细胞肺癌化疗疗效作为当年十一个重要成果之二。2006 年 ASCO 会议报道的 TREE 临床试验显示合理的使用化疗和靶向治疗可以使晚期大肠癌患者的中位生存期超过 2 年( FOLFOX +贝伐单抗组的中位生存期为 26 个月，CapeOx +贝伐单抗组的中位生存期为 27 个月)，其结果进一步确立了贝伐单抗在晚期大肠癌一线治疗中的地位。2007 年 ASCO 会议报道 IFL 方案(伊立体康、 - 氟尿嘧啶和亚叶酸)加 Avastin IV 期大规模 AVIRI5临床试验，结果显示结直肠癌中位存活期和无进展生存期明显延长。Avastin 除了与化疗药物联用外，2007年 ASCO 会议 Souglakos 报道 Avastin 联合靶向 EGFR 的单克隆抗体 Cetuximab (西妥昔单抗)可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。

　　Avastin 在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌等方面的治疗作用也引起了人们的关注，Johnson 等人进行了一项 II 期随机临床研究, 15mg/kg 的 Avastin 联合卡铂或紫杉醇治疗进展期非小细胞肺癌，可延长患者出现进展的时间(7.4 个月 vs 4.2 个月)及轻微延长生存期(17.7 个月 vs 14.9 个月)。2007 年 ASCO 会议上 Link等人报道使用 Avastin 联合紫杉醇白蛋白复合物治疗 40 例晚期转移性乳腺癌患者，20 例病情得到缓解，另有 7 例病情平均稳定期为 213 天。
(二) 化学抑制剂

　　1.内皮抑素(endostar，恩度)

　　1997 年，Reilly 等从小鼠血管内皮瘤( EOMA)细胞培养液中提取出一种血管生成抑制剂--血管内皮抑制素( Endostatin，ES)，简称内皮抑素，目前被认为是作用最强、效果最好、最广谱的肿瘤血管生成抑制剂。我国科学家首次将重组人内皮抑素( endostar，商品名：恩度)开发成抗肿瘤药物，2003 年 4 月～2004 年 7 月由中国工程院院士孙燕教授牵头，中国医学科学院肿瘤医院联合全国 24 家临床医院，对恩度进行了 493 例晚期 NSCLC 患者Ⅲ期临床实验，结果显示恩度联合长春瑞滨与顺铂具有协同作用，能明显提高晚期非小细胞肺癌的生存率，延长中位肿瘤进展时间，且安全性好。2005 年 9 月, 恩度获得中国国家药品监督管理局签发的新药证书。

　　恩度不是单纯的 Endostatin，是在 ES 母体上创造性的添加了 9 个氨基酸的新型 Endostatin，不仅使ES 稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加。与国外 Endostatin 样品相比，恩度的纯度明显增加，这也是恩度的剂量只有国外十分之一左右的原因。2006 年 Folkman 教授在动物试验上的研究证实，恩度抑瘤效果至少是 Endostatin 的两倍。

　　2.沙利度胺 (Thalidomide，反应停)

　　Thalidomide 通过下调 VEGF 而发挥抑制血管生成作用，还可降低肿瘤坏死因子( TNF-α) 的水平，诱导凋亡，调节自然杀伤细胞和 T 细胞的活性，对骨肉瘤具有很好的临床疗效。另外，Ⅱ期临床研究中Thalidomide 对肾细胞癌、前列腺癌、肝细胞癌也具有很好的疗效，该药已进入Ⅲ期临床试验。Thalidomide还可抑制患者体内白介素-6( Interleukin-6，IL-6) 和 C-反应蛋白(C- reactive protein，CRP) 的水平。 IL-2以为基础的免疫治疗的耐药和高水平的 IL-6 相关，因此 Thalidomide 联合 IL-2 治疗肾细胞癌可能有较高的有效率。

　　3.TNP-470 (烟曲霉素衍生物)

　　TNP-470 是烟曲霉素 (fumagillin) 的半合成类似物，抑制内皮细胞的增殖、游走及血管形成的作用较后者更强，毒性也低。该药与吉西他滨或顺铂联合使用，Ⅲ期临床用于宫颈癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等实体瘤治疗显示出了明显的抗肿瘤活性。

　　此外，还有许多仍处于临床前研究中的药物， BAY1229566 是 MMP-2、如MMP-3、MMP-9 和 MMP-13特异性抑制剂，该药通过抑制内皮细胞外基质的降解和嵌入而发挥抗血管生成活性；EMD121974 是 αvβ3和 αvβ5 整联蛋白对抗剂，临床前研究显示能够使黑色素瘤和脑瘤的癌细胞反应间延长；内皮他丁(endostain)和血管他丁(angiostain) 是来源于天然蛋白的多肽，具有抑制血管生成的活性，Ⅱ期临床研究结果显示可使病人的病情稳定时间延长，对进展期的神经内分泌瘤病人尤其显著。凝血酶敏感素(TSP-1) 是另一种天然的血管生成抑制剂；ABT-510 是一种仿内源性凝血酶敏感素的非肽取代物，ⅠB 期临床试验研究对 36 例患有不同肿瘤的病人进行治疗，病人病情稳定时间延长；CA4P 由美国 Oxigene 公司开发的新型抗肿瘤前体药物，在体外能与培养的人脐静脉内皮细胞微管蛋白选择性结合，诱发内皮细胞的凋亡；角鲨胺(Squalamine)是一种天然抗血管生成的固醇，在治疗移植人卵巢癌小鼠模型的实验中已被证实有效；VEGF-Trap 是含 VEGFR1 和 VEGFR2 胞外域融合蛋白结合到 IgG 的 Fc 片段的可溶性受体，大大降低了对患者的致敏性，通过抑制 VEGF 的作用而抑制肿瘤新生血管形成。

　　(三) 多靶点酶抑制剂

　　1.索拉非尼

　　索拉非尼( sorafenib)是一种双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，它具有双重抗肿瘤作用，一方面通过抑制 Raf/MEK/ERK 信号传导通路直接抑制肿瘤生长，另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性，包括 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 和 c-KIT 原癌基因，阻断肿瘤新生血管生成，间接抑制肿瘤细胞的生长。2005 年 12 月 20 日获美国 FDA 批准上市，是近十多年来世界上被批准的治疗晚期肾癌的第一个新药，是晚期肾癌治疗的重大进展。2006 年 9 月，Sorafenib(商品名：多吉美，拜耳)在中国经 SFDA 批准上市治疗转移性肾癌。

　　2007 年 ASCO 年会上报道了 TARGET 研究的最终报告，Sorafenib 与安慰剂相比显著延长晚期肾癌患者 PFS 和 OS，高水平 VEGF 和低水平 VEGF 的肾癌患者均可获益，但 VEGF 低水平的患者预后更好。2007 年 Josep M Llovet 教授在 ASCO 会议上揭晓一个重要研究结果(SHARP 研究)，sorafenib 首次被证实在晚期肝癌患者中应用可以延长患者的生存时间。

　　2.苏尼替尼

　　马来酸苏尼替尼( sunitinib malate，SU11248，商品名 Sutent)是由美国 Pfizer 药厂研发的一种新型的小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。对多种受体的酪氨酸激酶(RTKs)具有抑制作用，主要包括血小板衍生生长因子受体 β (PDGFRβ)、血管内皮生长因子受体 1、2、3 (VEGFR1、2、3)、干细胞因子受体(c-Kit)和胎肝激酶 3 (Flt3)。sunitinib 使对伊马替尼(imatinib，商品名 Gleevec) 耐药的胃肠道间质瘤患者的存活率提高了一倍以上。2006 年 1 月 26 日经美国 FDA 批准上市，用于治疗晚期肾细胞癌和胃肠道间质瘤。2007 年 ASCO 会议上报道了临床试验最新结果，所用亚组(根据 MSKCC 危险因素分组)的转移性肾细胞癌患者均从 sunitinib 治疗中获益，MSKCC 危险因素越少，PFS 越长。

　　3.范得它尼

　　范得它尼(ZactimaTM、Vandetanib，ZD6474) 是一种合成的苯胺喹唑啉化合物，为口服的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，可同时作用于肿瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和 RET 酪氨酸激酶。Ⅱ期研究结果显示，Vandetanib 治疗进展期遗传性甲状腺髓样癌的疗效明显且毒副作用小，使用 Vandetanib 后，血浆肿瘤标志物降钙素和癌胚抗原分别较基线值下降了 72 %和 25 %。为此2006 年 2 月，FDA 给予阿斯利康公司开发的髓质型甲状腺癌治疗药物 Zactima TM(ZD6474) 快速审批资格，所针对的适应证为滤泡型、髓质型、未分化型、以及局部复发或转移的乳突型甲状腺癌。

　　(四) 信号转导酪氨酸激酶抑制剂(TKI)

　　1.吉非替尼

　　吉非替尼(ZD1839,IRESSA，Gefitinib，易瑞沙)是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制药，可以通过与 EGFR 的 ATP 结合位点上的三磷酸腺苷竞争，阻断酪氨酸激酶活性，进而通过 AKT和 MAPK 途径阻断参与肿瘤生长与转移的 EGFR 信号传导通路，并通过阻断血管生成相关的信号途径，发挥出抑制肿瘤新生血管作用。

　　Gefitinib（吉非替尼，易瑞沙） 是肺癌靶向治疗中较为成熟的药物，全世界已有 10 余万病例报告，已在很多国家上市。2006年 Uramoto 等人证实 EGFR 基因突变，将有助于预测肺癌用药 Gefitinib 的使用疗效，其中以女性、腺癌和不吸烟患者突变率较高。2007 年 ASCO 会议上进一步报道 EGFR 外显子 19 或 21 基因突变的患者使用Gefitinib 治疗生存期明显延长。因此得出结论亚洲人种、女性、不吸烟、腺型、 评分好的患者对 GefitinibPS的疗效较好。

　　2.埃罗替尼(Tarceva，erlotinib)

　　盐酸埃罗替尼是一种小分子 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，它通过抑制 ATP 与细胞内 TK 的结合抑制磷酸化，此外还可以阻断 VEGF、bFGF 和 TNF-α 的产生，从而阻断信号传导，干预肿瘤血管生成、细胞的增殖、分化等过程。2004 年 11 月 19 日，美国 FDA 批准 Erlotinib 用于一线化疗失败的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。
(五) 抗血管生成中药

　　近年的研究表明，某些抗肿瘤中药提取的有效成分显示出较强的抑制肿瘤新生血管作用，包括人参提取物人参皂甙 Rg3，大豆经发酵后提取物染料木黄酮、姜黄、郁金和莪术提取物姜黄素，青篙提取物青篙琥酯等。亦有研究者报道某些抗肿瘤中药复方制剂参麦注射液、薏苡仁、复方丹参注射液等均具有抗肿瘤血管生成的作用。

　　目前人们正在研究这些中药及提取物的抗肿瘤血管生成作用机制，研究表明，人参皂甙 Rg3 可通过下调肿瘤 VEGF 表达抑制肿瘤新血管生成；染料木黄酮对多种血管生长因子如 VEGF、bFGF 和 TGF 等有明显的抑制作用；姜黄素可影响肿瘤血管内皮细胞增殖周期和诱导凋亡，下调肿瘤 VEGF 基因的表达，并抑制基质金属蛋白酶的活性；青篙琥酯能抑制内皮细胞增殖、迁移、小管形成和下调肿瘤 VEGF 表达；参麦注射液可抑制内皮细胞增殖、迁移并抑制肿瘤 bFGF 和 MMP-2 表达；薏苡仁注射液(康莱特)能明显抑制新生血管生成，加快血管进入衰退期；复方丹参注射液抑制肿瘤细胞与内皮细胞黏附及黏附分子表达，发挥抗血管生成作用。

　　(六) 抗血管生成化疗药物

　　紫杉醇(Paclitaxol)是一种微管稳定的细胞毒药物，在体外紫杉醇可剂量依赖性地抑制内皮细胞在Matrigel 基底膜上的增殖、运动、侵袭和条索形成，并且这种抗血管生成活性与其细胞毒作用不相关联，因为其抑制内皮细胞趋化和侵袭作用所需的药物浓度远低于其影响到内皮细胞增殖需要的浓度，提示除其已证明的直接细胞毒抗肿瘤作用外，紫杉醇还可通过抑制血管生成而间接引起抗肿瘤作用。Clements 等的研究表明，伊立替康(CPT)和拓朴替康(TPT)在体外以非细胞毒方式抑制人内皮细胞生长，而且这种抑制作用可持续至药物去除后 96h，并观察到 CPT 和 TPT 与 TNP-470 一样可有效抑制体内血管生成模型中的血管生成。

　　此外，环磷酰胺、氟尿嘧啶、阿霉素等在体外实验中可抑制内皮细胞增殖；在鸡胚绒毛尿囊膜血管形成模型中，阿霉素、鬼臼乙叉甙、长春新碱引起微血管形成数目明显减少；在动物角膜血管生成实验中，环磷酰胺、甲胺喋呤、TPT 等也显示出抗血管生成作用。

　　四、抗血管生成给药方式

　　抗新生血管治疗是一个长期、慢性的治疗过程，临床研究发现 Endostatin 低剂量、持续给药比大剂量给药效果更好。肿瘤对于给药剂量会产生不同的反应，如进入Ⅱ/Ⅲ 期临床试验的 VEGF 单抗Bevacizumab 治疗晚期直肠癌时，使用 5mg/kg 剂量时对 40% 病人有效，而使用 10mg/kg 剂量时只对 24%病人有效；当用它治疗非小细胞肺癌时 15mg/kg 剂量比 7.5mg/kg 更有效。由于抗血管生成治疗的靶目标是肿瘤血管内皮细胞，通过抑制新血管生成间接抑制肿瘤细胞生长和转移，因此其用药方式也应符合内皮细胞的生理特性。

　　(一) 持续低剂量给药方式

　　国外已有文献报导，多种常规化疗药物具有抗血管生成活性，并且这些化疗药物抑制血管生成所需浓度明显低于其杀伤肿瘤细胞需要的浓度。Drevs 等分别测定了 阿霉素、去甲柔红霉素、氟尿嘧啶、紫杉醇和 足 叶 乙 甙 对 人 内 皮 细 胞 (HUVEC) 、 人 乳 腺 癌 细胞 (Mcf-7) 、 黑 色 素 瘤 细 胞 (Skmel) 、 肝 癌 细 胞(Huh7/Alexander)、肺癌细胞 (A549/LXFL)、结肠癌细胞(Dld)和鼠肾癌细胞(RENCA)的细胞毒作用，结果显示这些药物对内皮细胞 IC50 值(4.02E-06－ 6.16E-14 M)明显低于肿瘤细胞(7.44E-02－1.9E-11 M)。可见，活性增殖的内皮细胞较肿瘤细胞对这些化疗药物更敏感。由此理论上我们可通过降低化疗药物的浓度以特异性地靶向于肿瘤内皮细胞。将这种低浓度的化疗药物长期持续使用，可避免常规化疗方案中内皮细胞在化疗间歇期的恢复，增加了抗血管生成效果。目前将这种连续规律的低剂量化疗(metronomic chemotherapy)称为抗血管生成化疗(antiangiogenic chemotherapy)，这种给药方式称为抗血管生成给药方式。

　　已有一些实验表明化疗药物的这种抗血管生成给药方式显示出较好的治疗效果，而且这种给药方式可避免常规最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)化疗方案易产生耐药性的难题，并对经 MTD 方案治疗已产生耐药的肿瘤仍有治疗效果。我们研究组曾应用环磷酰胺持续低剂量用药计划治疗 Lewis 肺癌小鼠，以及低剂量希罗达治疗 4T1 乳腺癌小鼠，结果证实了化疗药物低剂量给药计划在体内的抗血管生成作用。由于持续低剂量用药计划靶点为内皮细胞，其遗传性质稳定，不易产生耐药。相对于最大耐受剂量化疗方案，持续低剂量给药计划对骨髓造血系统、胃肠粘膜等化疗敏感组织毒副作用小，可以长期持续使用，可改善生存质量，延长生存期。国外一项对复治的转移性乳腺癌病人应用低剂量甲胺喋呤(2.5mg bid 2d/w)和环磷酰胺(50mg/d)治疗的大规模临床研究结果显示，总有效率为 38%，而且毒副作用很小。治疗有效的病人在治疗后两个月内即出现血清血管内皮生长因子(VEGF)水平下降，而三个治疗无效的病人 VEGF 水平升高，提示该治疗与抗血管生成作用相关。

　　(二) 联合给药方式

　　如何把多种有效的药物合理地联合应用，以最大限度地增加抗血管生成的疗效是临床亟待解决的问题。许多研究者已把这种理念贯穿于正在进行的临床研究中。2007 年 ASCO 会议上，Sablin 等报道的一项在 90 例晚期肾癌患者中序贯使用 sorafenib 和 sunitinib 的回顾性分析提示，两者无交叉耐药性，但首先使用 sorafenib 似乎更为合理，sorafenib 进展后的患者在使用 sunitinib 可获得 20%的 PR，有更好的生存趋势。同时此会议上 Souglakos 报道 Avastin 联合靶向 EGFR 的单克隆抗体 Cetuximab 可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。

　　低剂量抗血管生成化疗计划的抗血管生成效果也可因合用一种特异靶向于内皮细胞的药物而明显提高，这些药物如 VEGFR-2 单克隆抗体(DC101)、小分子 TNP-470、基质金属蛋白酶-2 片段 PEX、内皮素抗体等。例如，Klement 等将 DC101 与 VLB 联合应用，发现较其单独应用可更好地控制肿瘤生长，组织病理学显示联合治疗组内皮细胞坏死更为明显。我们曾在 CTX 低剂量给药计划中联合应用人参皂甙，二者显示出协同抗血管生成作用，且毒副反应小，不易产生耐药，抑瘤效果显著且持久，生存期得到延长。其它化疗药物如 DDP、EADM 和 Taxol 等的抗血管生成给药计划中加入 VEGFR 抗体的增效作用也有报道。

　　五、展望

　　抗血管生成治疗属于恶性肿瘤综合治疗的一部分，这种疗法虽然不直接杀死肿瘤细胞，但可通过抑制肿瘤血管生成间接控制肿瘤生长和转移，使肿瘤细胞处于稳定状态，有望使病人长期带瘤生存。从循证医学的角度看，肿瘤病人疗效判定的终点指标应为生存期的延长或生活质量的提高，因此，抗血管生成疗法将为肿瘤治疗，特别是晚期恶性肿瘤的治疗提供一种有效的方法。但目前在抗肿瘤血管生成药物的临床研究中仍有一些问题需要解决，如临床试验的最佳剂量和用药时间的确定、抗血管生成效果的评定、动物试验与临床研究结果的差异等问题，相信随着医疗科技的迅速发展和进步，这些问题都将逐渐被解决。

肿瘤抗血管生成治疗
摘要：本小型综述重点突出了血管稳定化的作用，而血管稳定化显然是由于隶属于促

血管生成类和抗血管生成类因子介导的。众所周之，血管形成素－1具有促血管生成的特性，而内皮抑素起到抗血管生成的作用。但这两种在试验肿瘤模型中都具有抑制肿瘤生长的作用。它们作用机理的共同点就是它们都是对血管稳定性和血管渗透性起作用的重要因素，它们不仅对肿瘤的血管生成作用，而且通常也对组织血管生成作用具有极重要的影响。血管形成素－1 和内皮抑素都减少了血管渗透能力，而促进了血管稳定过程。在肿瘤的实验性的治疗中，采用如内皮抑素这类血管生成拮抗剂，显著提高了血管稳定作用。它们抑制了肿瘤生长和可能出现的肿瘤转移。对致力于肿瘤血管化作用和抗肿瘤血管生成治疗的科学家来说，了解血管稳定作用的时间和空间过程是及其重要的挑战。
1. 引言

肿瘤血管系统的一个基本的特性就是缺少血管体系，这表明发生在正常血管发展过程中的形态学的再塑性过程在肿瘤的血管发生中或是受损的或是没有发生[1-3]。生理条件下以及肿瘤的组织血管化作用是由血管发生和/或血管发生引起的。从已存在的血管上萌芽出新的血管定义为血管发生[4，5]，而出生后的血管发生是内皮前体细胞形成新的血管的过程[6-8]。
新生血管发展整个复杂过程中的主要步骤包括内皮细胞的迁移和增殖过程以及毛细血管的形成[9]。随后的基底膜的发生和内皮周细胞，毛细血管周细胞和大血管的平滑肌细胞整合入血管壁都是导致血管成熟的血管再塑性过程中的基本步骤[1，10-12]。这个成熟过程的结束是由小血管和大血管形成，可以满足例如形成流体静力压、血管渗透能力和组织灌注率等功能需要的血管体系的形成。目前血管发生研究的注意力主要集中于内皮细胞的迁徙、增殖和毛细血管的形成。相应的肿瘤抗血管生成治疗也主要针对内皮细胞的这些特性。然而，血管壁的结构稳定作用的机制目前我们了解甚少，但是在最近几年中已经成为血管研究中的非常重要的热点[1-3，11，13-18]。对血管稳定作用是否影响和怎样影响肿瘤生长和转移这个问题就更知之甚少。此外，对于像肿瘤、糖尿病、黄斑变性、各种血管畸形、炎症和局部缺血组织的最终血管再通这些一系列以血管异常为主要特征疾病，血管稳定过程的调节看起来都是重要的。

2. 肿瘤组织中的血管稳定和血管成熟

正常的一个成熟血管床由分化后的大血管和微血管等血管组成，这包括动脉、静脉、小动脉、小静脉和末端毛细血管。除了被肿瘤侵犯包含的已存在的血管外，不管是恶性肿瘤还是良性肿瘤中，这样一种已分化的血管床都没有存在肿瘤中[1，3，19]。“血管成熟”、“血管稳定”或“血管正常化”这些术语既用于不同的也用于同样的血管结构状态。由McDonald和其同事进行的详细研究证明大部分肿瘤血管系统已经存在基底膜和内皮周细胞。由于缺乏进一步分化和周细胞的规则地整合进入血管壁和血管壁成分的重排，肿瘤血管系统的基底膜和内皮周细胞仍然保持结构的不成熟[11，13]。此外，与正常血管系统相比，肿瘤血管系统也存在结构的不正常。因而，在一些最近的出版物中并不赞成在“正常化”这个概念使用中把血管稳定和血管成熟分开使用。特别必要的是在此领域要避免这一概念的进一步混淆。因而，我们建议使用“血管成熟”定义为大血管和微血管的正确分化为血管床的过程，而新血管完成由或多或少的内皮间结构、基底膜和一层内皮周细胞的结构状态称之为“血管稳定作用”。血管稳定作用是成熟过程中的一步，但是这一阶段中血管依然需要几步重新塑形的步骤才能成熟。不过，肿瘤的一部分血管能够明显地达到血管形态发生阶段，但是不能进入进一步的血管成熟阶段。因而，区分这些过程不仅仅是一个技术问题，更进一步意义上说，这对更好地理解肿瘤血管生物特性和肿瘤抗血管生成治疗都是非常重要的。
3. 血管稳定和肿瘤生长

通常大家认为，肿瘤血管是不稳定的和不正常渗漏的[19，20]。大分子的外渗提供了一种基质扩大了血管芽苞的形成的可能[19]。许多出版物也认为肿瘤血管床是由不同形态发生血管结构组成。无论是哪种类型的肿瘤，肿瘤组织中的肿瘤血管基本上存在三种类型：

（1）仅由内细胞无或仅存在未充分形成的基底膜，但没有整合内皮周细胞形成的

新生血管芽苞（图1A）。

（2）固定在部分形成的基底膜和部分排列的内皮周细胞上由内皮细胞排列成的毛细血管（图1B）和（3）毛细血管（图1C）和具有基底膜及其固定在上面的内皮细胞和内皮周细胞或少量整合了少量平滑肌细胞的较大直径的血管（图1D）。只有最后一种的血管结构被认为是稳定的。哪一种血管类型在肿瘤中占统治地位显然依赖肿瘤内的微环境。然而，我们要说明的是在人Leydig（睾丸间质细胞）细胞肿瘤，尽管存在非常高的血管密度，这种非常低度恶性肿瘤的大部分血管是稳定的[16]。根据这些数据，我们假定血管稳定可能不利于肿瘤的生长和转移。在一个肿瘤中调控血管的过程如此复杂，使得研究肿瘤组织中调节血管稳定的分子机制是困难的。过去4-5 年中的数据的累积增加这一问题显著性的关注[11，14，21，22]。相应的，我们把近来在抗血管生成治疗下肿瘤血管的部分正常化称作“正常化”[2，15]。这引起这样的假设，抗肿瘤血管生成治疗可能会打开改善放疗和化疗效果上的一个“治疗窗口”[2，15]。我们显示了血管形成抑制剂内皮抑素稳定了新血管芽苞，猜测这将会使新血管从生成血管向静止的表型转换（图2A，B）。另一方面，血管形成素－1（Ang1）的过表达，通过整合内皮周细胞进入血管壁和显示促血管生成特性作为新初生血管的重新塑形和稳定的基本因素，抑制了肿瘤的生长而不是促进它的生长[22]。近来研究发现的那些被强调的数据显示，一种能够结合血管形成素－1 位点的包含孤立纤维蛋白素原样受体的切去顶端的血管形成素－1 变异单体和血管形成素－1，均能稳定血管，避免异常的血管渗漏和降低血管密度[23]。血管形成素－1 和内皮抑素的共同点看起来都能重新塑造和稳定新生血管，而它们的差异在于如内皮细胞的迁移和管腔的形成等中发挥不同的功能。内皮抑素阻断了内皮细胞的迁移，减少了血管内皮细胞生长因子诱导的内皮管腔的形成[14]，而血管形成素－1 则是都增强这些作用[24，25]。血管稳定影响到血管渗透性和血流的功能。血管形成素－1 阻断了血管内皮细胞生长因子诱导的血管渗漏[26]。我们目前的数据显示内皮抑素通过稳定血管壁（Nomi and Schuch 等，待发手稿）阻止了血管内皮细胞生长因子和凝血酶原激活因子介导和肿瘤诱导的异常血管渗漏。对抗血管内皮细胞生长因子或凝血酶原激活因子，内皮抑素保护了内皮细胞间的连接和基底膜以及在内皮细胞和内皮周细胞间的直接接触。我们最近的证据显示的治疗中应用的内皮抑素明显地集聚在肿瘤血管壁内，在正常组织中却没有集聚[27]这表明了内皮抑素在新生血管结构调整中的作用。另有发现支持这一观点，通过减少血管通透性过高，内皮抑素显示可以阻断血管内皮细胞生长因子诱导的视网膜剥离[28]。更有近来的研究证据支持这一点，缺乏内皮抑素前体物质-胶原18 的人工破坏特定基因的鼠表现出升高的血管渗透性或血管渗漏[29]。显然，血管形成素－1 和内皮抑素协同作用于血管壁的稳定和减少血管渗漏。最终，这两种因子遏制了试验肿瘤的的肿瘤生长和转移[22，30]。近来一篇文章显示了血管渗漏对肿瘤生长的重要性。可能是由于稳定了内皮屏障，通过一种影响一氧化氮合酶的因子-Cavtratin（凯绰琳），从而阻断了血管通透性过高，减少了活体内肿瘤的生长。但这又提出了一个问题是不是血管稳定是抗血管生成和抗肿瘤血管生成的本质？如果答案是，血管稳定又怎样抑制了肿瘤生长？稍微违反直觉的考虑一下，正如我们所显示的内皮抑素这些现有证据表明，血管稳定可能是逆转肿瘤诱导的异常血管渗漏和减少血管生成潜能的关键(Nomi and Schuch 等, 待发手稿) [14]。对不同试验和人类的形态学评价揭示肿瘤血管的稳定改变了与血管相关的肿瘤细胞的结构以及伴随的肿瘤坏死的增加。在肿瘤的边缘区域，肿瘤细胞群被一团高密度的未稳定血管网络包围（图3A），这里没有看到坏死区域。与此相反，在那些部分稳定血管系统的肿瘤区域，只有包围稳定血管周围5－9 层肿瘤细胞呈圆筒状存活，而远离这些区域的肿瘤细胞则坏死（图3B，C）。由这样稳定的大直径血管分枝的小血管则发现退化了（图3D）。有趣的是，这样有稳定血管和肿瘤坏死的区域大部分发现在恶性肿瘤的中心而在象睾丸间质细胞瘤或良性前列腺异常增生中则没有发现。在几个实验性肿瘤中，我们观察在内皮抑素抗肿瘤血管生成的治疗下到从肿瘤中心向肿瘤边缘区域显著的具有稳定血管和肿瘤坏死的区域，重点指出了在血管生成抑制、血管稳定和肿瘤抑制的潜在关系。
肿瘤血管稳定性的超微结构（A）一个不稳定的肿瘤边缘区域的血管由内皮细胞（EC）和形成的部分基底膜（箭头）组成。在血管形成的这一时期看不到内皮细胞之间的特异连接区。（B）一个肿瘤边缘区域部分稳定的的血管由血管由形成基底膜的内皮细胞和围内皮细胞（PEC）组成。（C）在肿瘤中心区域的稳定的血管显示了内皮细胞间的连接（箭号）和基底膜（箭头），其中内皮细胞（EC）和围内皮细胞（PEC）都存在。（D）肿瘤中心区域的大血管的血管壁结构由具有内皮细胞间连接（箭号）的内皮细胞（EC）和一层紧密连接内皮细胞的平滑肌细胞（SMC）组成。Er：红细胞。
内皮抑素的血管稳定作用（依据[14]）（A）在新生血管壁可以检测到内皮抑素（ES）的增加。（B）内皮抑素定位于内皮细胞间连接和血管壁的基底膜的透明板区域的超微结构。这一假说认为内皮抑素作用于新血管的稳定，使它们从血管生成向休眠表型的转换。这一过程会减少血管生成和血管渗漏的活性。
肿瘤组织内的血管稳定作用。（A）肿瘤边缘区域的肿瘤细胞群是由围绕在肿瘤细胞群落（虚线）周围的致密毛细血管网（箭号）来提供营养。（B）在肿瘤中心，远离稳定血管的肿瘤细