白头翁皂苷的分离提纯.pdf

1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/文章编号:100524014(2004)0120018204白 头 翁 皂 苷 的 分 离 提 纯刘 琳,金凤燮(大连轻工业学院 生物与食品工程学院,辽宁 大连 116034)关键词:白头翁皂苷;薄层层析;大孔树脂吸附层析;硅胶柱层析摘要:酒精溶剂浸提得到较粗的白头翁总皂苷,脱脂后,经大孔树脂层析得到高产、高纯的白头翁总皂苷,得率为9.4%。总皂苷经硅胶柱层析得到无色的、纯度较高的单体皂苷,得率为22.8%。通过薄层层析把纯化的单体皂苷与标准品白头翁皂苷 进行对照,分离纯化的单体皂苷与标准品相同,是32O2 2L2鼠李糖基(12)2 2L2阿拉伯糖苷23,232羟基2 20(29)2羽扇豆烯2282O2 2L2鼠李糖基(14)2 2D2葡萄糖基(16)2 2D2葡萄糖酯苷。中图分类号:Q946.49,Q503文献标识码:ASeparation and purification of pulsatilla saponinL IU Lin,JIN Feng2xie(Coll.of Bio.&Food Technol.,Dalian Inst.of Light Ind.,Dalian 116034,China)Key words:pulsatilla saponin;thin2layer chromatography;macroporous resin;silica gel columnAbstract:In separating and purifying pulsatilla saponin,the pulsatilla saponin gained from alcohol solventimmersed liquid are degreased and separated through macroporous resin.Then,high yield and high puritypulsatilla saponin is obtained with a yield rate of 9.4%.Finally,decolored and separated through silica gelcolumn,monomer saponin is obtained with a yield rate of 22.8%.Comparing with standard specimen,it isthe same as 32O2 2L2rhamnppyranosy(12)2 2L2arabinopyranoside23,232dihydroxyl2 20(29)2lup2282O2 2L2rhamnppyranosy(14)2 2D2glucopyranosyl(16)2 2D2glucopyranoside.白头翁性味苦寒,具有清热解毒,凉血止痢,燥湿杀虫等功效,自古就是中医中常用的为民解除病痛的药物。现代医学主要用来治疗赤白痢疾,鼻衄,崩漏,眼目赤痛等。白头翁粉能杀灭阴道滴虫,水煎剂和醇提总皂甙具有抗阿米巴原虫的作用1。白头翁抗菌性广泛,能抑制金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、枯草杆菌等的生长2。此外,白头翁及其复方如白头翁汤对皮肤真菌、酵母菌、锥虫、白色念珠菌等菌有抑制作用3。白头翁对小白鼠流感病毒感染有轻度抑制作用4,白头翁的乙醇提取物还有镇静镇痛作用。白头翁还具有一定的抗癌作用,并提出白头翁抗肿瘤作用主要是通过其直接作用于肿瘤细胞所致5。白头翁的化学成分研究610始于60年代初,共分得了约14种成分,主要为皂苷和内酯等成分,目前认为白头翁的有效化学成分主要为三萜皂苷。科研人员以双糖三萜皂苷为对照品用分光光度法对不同采收期白头翁的根及茎叶总皂苷分别进行测定11,结果表明根内总皂苷含量高于茎叶,且开花前期含量最高。所以在早春35月采挖药材品质较好。许多中草药的主要药效成分是皂甙,如人参、黄芪、刺五加等,长期以来,皂甙由于具有多种生理活性和良好的药理作用,一直是天然有机化学和药物化学的重要研究对象。本文主要研究了白头翁皂苷分离提纯的方法。白头翁总皂苷依次通过大孔树脂层析、硅胶柱层析得到较高纯度的白头翁皂苷,并利用薄层层析鉴定分离物。白头翁皂苷的分子式如图1所示。第23卷第1期2 0 0 4年3月 大 连 轻 工 业 学 院 学 报 Journal of Dalian Institute of Light IndustryVol.23,No.1Mar.2 0 0 4收稿日期:2004201206基金项目:国家自然科学基金资助项目(20076007,30371744).作者简介:刘 琳(1979),女,硕士研究生.1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/白头翁皂苷:R1=2L2rha2(12)2 2L2ara2R2=H2白头翁皂苷:R1=2L2ara2R2=2L2rha2(14)2 2D2glc2(16)2 2Dglc2白头翁皂苷:R1=2L2rha2(12)2 2L2ara2R2=2L2rha2(14)2 2D2glc2(16)2 2D2glc2图1 白头翁皂苷的化学结构式1 材料与方法1.1 实验材料白头翁皂苷 标准品:广州暨南大学叶文才教授提供;白头翁总皂苷:实验室自制;薄层层析板:Silica Gel260F254德国Merck产品;大孔吸附树脂:商品号AB28树脂,南开大学化工厂,商品号D2280树脂,南开大学化工厂;硅胶:青岛海洋化工厂分厂;所用化学试剂均为分析纯。1.2 实验方法1.2.1 白头翁总皂苷粗品的制备取一定量的白头翁,粉碎成粉,加入70%的酒精浸泡24 h,纱布、滤纸过滤后,收集滤液,滤渣继续加入酒精浸泡,同上法方法循环3次,收集滤液,将3次所得滤液混合。滤液经减压浓缩为原来的体积的1/5,再用1/3体积的石油醚萃取脱脂,保留水相,再次减压浓缩后,加水稀释上AB28柱吸附,反复吸附3次,68倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积70%酒精洗脱。然后,用95%酒精洗脱再生柱子。70%酒精洗脱液,经脱色减压浓缩后蒸干。流程为白头翁粉(50目)酒精浸泡 减压蒸馏、浓缩 石油醚萃取(3次)溶于水(3倍体积去离子水)AB28柱吸附 酒精洗脱 D280脱色 已脱色的皂甙水浴蒸干,干燥器干燥24 h称重。AB28树脂柱的预处理:将AB28树脂用去离子水浸泡10 h充分溶胀,滤去水、浮游物和破碎树脂后,水洗至澄清。再用2 mol/L NaOH浸泡810 h并不时搅拌,除去碱液,水洗至中性,再经2 mol/L HCL浸泡810 h并不时搅拌以除去新树脂中的各种杂质,除去酸液后水洗至中性然后用95%乙醇浸泡46 h并不时搅拌,继续用酒精洗脱直至洗出液滴入水中不呈现乳白色混浊为止,再用去离子水洗去酒精,装柱备用。D280树脂柱预处理:将树脂以水浸泡一昼夜后进行反洗和正洗,洗至水清亮无色。再以树脂体积2倍的3%4%NaOH和3%4%HCl交替处理,以“碱2水2酸2水”为1个循环,至少处理3个循环,预处理后以23倍树脂体积的3%4%NaOH水溶液再生,并以阳床H型交换水洗至pH 89即可投入使用。将D2280树脂装柱,柱体积约等于待脱色液样品1/3,控制样品中皂甙浓度为7%8%,将样品上柱,控制流速约为3 mL/min,收集流出液,待样品全加过后,加3倍柱体积的95%酒精洗柱,收集流出液减压浓缩,蒸干。本次实验所用AB28树脂柱:柱径9.5 cm,柱高22 cm,柱体积1 558 cm3。D2280脱色柱:柱径8.8 cm,柱高41 cm,柱体积2 500 cm3。1.2.2 硅胶柱分离白头翁皂苷 称取白头翁总皂苷粗品加入适量80100目的硅胶,放入瓷碗中并倒入氯仿和甲醇V(氯仿)V(甲醇)=11混合液搅拌使固体粉末充分溶解,置于60 水浴锅上加热,待溶剂挥发后即成样品胶。然后,在底部塞有棉花的硅胶柱里装入200300目的硅胶(分离胶),保持上表面水平,抽真空使之细密均匀,再装入干燥好的样品胶并其表面铺上棉花层。柱装好后,首先用纯氯仿通柱,柱子打通后,需逐渐增加甲醇浓度,最终以V(氯仿)V(甲醇)=73的流动相洗脱。TLC跟踪检测结果,根据结果分别收集。1.2.3 薄层层析鉴定白头翁皂苷的方法将薄层层析板在110烘箱活化3060 min,用微量点样器吸取标准品及样品,点样于薄层层析板上。每次点样依照样品质量浓度确定点样次数,每次点样均须用电吹风吹干。将点好样品的薄层板放入层析缸,浸入展开剂V(氯仿)V(甲醇)V(水)=730.5的深度为距薄层板底边0.51.0 cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封盖,待展开至规定距离(一般为5.5 cm)后,取出,吹干溶剂,喷10%H2SO4水溶液后,用电吹风吹干显色约5 min。样品的制备:取白头翁皂苷 标准品3 mg加入1 mL甲醇制成标准品,可直接吸取。取自制白头翁皂苷纯品1 mg加入1 mL甲醇溶解制成待测样品。91第1期 刘 琳等:白头翁皂苷的分离提纯 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/2 结果与讨论2.1 大孔吸附树脂分离白头翁总皂苷取500 g白头翁,粉碎成后用3 000 mL 70%的酒精浸泡24 h,纱布、滤纸过滤,收集滤液。滤渣再加入2 500 mL 70%酒精浸泡24 h,纱布、滤纸过滤,收集滤液。滤渣再加入2 200 mL 70%酒精浸泡24 h将3次所得滤液混合共计6 200 mL。滤液经减压浓缩萎2 000 mL,再用1/3体积的石油醚萃取脱脂,保留水相1 540 mL,再次减压浓缩后,加4 500 m;去离子水稀释上AB28柱吸附,反复吸附3次至皂甙完全吸附后,用12 L水洗掉糖,再依次用7 500 mL70%、4 500 mL95%酒精洗脱。70%酒精洗脱液上D280脱色柱(预处理好),得到无色的皂甙液减压浓缩后再用水浴锅蒸干,最终得到白头翁皂苷粗品47.2 g。TLC如图2,从图2可看出,白头翁总皂苷中主要成分是白头翁皂苷,还有部分低糖基皂苷。2.2 硅胶柱分离白头翁皂苷称取22.2 g白头翁总皂苷粗品加入66 g80100目的硅胶,放入瓷碗中并倒入氯仿和甲醇 标:白头翁皂苷 标准品;70%酒精:70%酒精洗脱得到的白头翁皂甙粗品图2大孔吸附树脂分离白头翁总皂苷的TLC图谱(11)混合液搅拌使固体粉末充分溶解,置于60 水浴锅上加热,待溶剂挥发后即成样品胶。然后在底部塞有棉花的硅胶柱里装入440 g200300目的硅胶(分离胶),保持上表面水平,抽真空使之细密均匀,再装入干燥好的样品胶并其表面铺上棉花层。氯仿通柱后,以每次200 mLV(氯仿)V(甲醇)=73的流动相洗脱。TLC跟踪检测结果如图3,TLC结果归纳如表1。0:白头翁五糖苷标准品;其他数字代表瓶号图3 硅胶柱分离白头翁皂苷 为主要成分的总皂苷的TLC图谱02 大 连 轻 工 业 学 院 学 报 第23卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/ 表1 白头翁皂苷 为主要成分的总皂 苷分离收集表序号瓶号成分收集干重/g得率/%1119无白头翁皂苷 1.255.62202290%白头翁皂苷 1.597.23232995%白头翁皂苷 4.1818.843037单点白头翁皂苷 4.6120.85384090%白头翁皂苷 0.924.16414965%白头翁皂苷 4.5120.3总量17.0676.9 由表1可知,白头翁皂苷 的分离较为成功,说明硅胶柱可用于白头翁单体皂苷的分离,洗脱剂为V(氯仿)V(甲醇)=73。白头翁皂苷 的得率是20.8%。重复3次实验结果一致。2.3 白头翁皂苷 的鉴定用微量点样器吸取标准品及样品,点样于薄层层析板上。标准品点3次,待测样品点10次,每次点样均须用电吹风吹干。将点好样品的薄层板放入层析缸,浸入展开剂,密封盖,待展开至规定距离(一般为5.5 cm)后,取出,吹干溶剂,喷10%H2SO4水溶液后,用电吹风吹干显色。结果如图4。标:白头翁皂苷 标准品;样品:提纯的白头翁皂苷 图4 白头翁皂苷 标准品与提纯的白 头翁皂苷 TLC对照图谱TLC图谱中,标准品与待测样品的Rf值相同,即所提纯的物质与标准品相同为白头翁皂苷。3 结 论大孔吸附树脂分离白头翁皂苷的方法简便、可行可靠,具有较高的回收率,回收率为9.4%。硅胶柱层析分离白头翁皂苷,从经济效益和分离结果两方面考虑,流动相为V(氯仿)V(甲醇)=73较为合适。白头翁皂苷 的回收率为20.8%。薄层层析法比较自制提纯的白头翁皂苷 与标准品白头翁皂苷,其Rf值相同,初步断定为同一种物质,即32O2 2L2鼠李糖基(12)2 2L2阿拉伯糖苷23,232羟基2 20(29)2羽扇豆烯2282O2 2L2鼠李糖基(14)2 2D2葡萄糖基(16)2 2D2葡萄糖酯苷。参考文献:1王浴生.中药药理与应用M.北京:人民卫生出版社,1983.330.2李仪奎.中国药理实验方法学M.北京:人民卫生出版社,1991.162.3江苏新医学院.中药大辞典:上册M.上海:上海人民出版社,1977.703.4叶文才,赵守训,刘静涵.中药白头翁化学成分的研究J.中国药科大学学报,1990,2(5):264.5蔡 鹰,唐永明,梁秉文.白头翁体外抗肿瘤实验研究J.中草药,1999,30(6):441-443.6 YE W C,ZHAO S X,LIU J H.Chemical constituentsofPulsatilla chinensis()J.J Chin Pharm Univ,1990,21(5):264-266.7 YE W C,J I N N,ZHAO S X,et al.TrierpenoidsfromPulsatilla chinesnsisJ.Phytochemistry,1996,42(3):799-802.8 YE W C,OU B X,J I N N,et al.Patensin,a newsaponin fromPulsatillapatens var MultifidaJ.Phyto2chemistry,1995,39(4):937-939.9 YE W C,HE A M,ZHAO S X,et al.Pulsatilloside Cfrom the roots ofPulsatilla chinensisJ.J Nat Pral,1998,61(5):658-659.10 YE W C,PAN G S,ZHANG Q W,et al.Five newTriterpene saponins fromPulsatilla patensvar.Multi2fidaJ.J Nat Prod,1999,62(2):233-237.11周素娣,王旭敏,陈春明.不同采收期对白头翁中总皂甙含量的影响J.中药新药与临床药理,1998,9(1):3-5.12第1期 刘 琳等:白头翁皂苷的分离提纯