生物制品分析概论市公开课一等奖百校联赛优质课金奖名师赛课获奖课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,生物制品分析概论,第二军医大学药学院,1/64,本章内容,背景概述,判别试验,杂质检验,含量（效价）测定,2/64,第一节 背景概述,生物药品（,Biopharmaceutics或Biopharmaceuticals,）是利用生物体、生物组织或组成生物体各种成份，综合利用,生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学,原理与方法制得一大类药品。,广义生物药品应包含从动物、植物和微生物等生物体中直接制取各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成天然物质类似物。,一、生物药品与生物制品,3/64,生物药品发展,第一代生物药品：利用,生物材料加工制成,含有一些天然活性物质与混合成份粗提物制剂,甲状腺粉及其片剂、鱼肝油与鱼肝油酸钠注射液、胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊等,第二代生物药品：依据生物化学和免疫学原理，,应用近代生化分离纯化技术,从生物体制取含有针对性治疗作用特异生化成份,尿激酶、肝素钠、抑肽酶、胰岛素、人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子、人纤维蛋白原,4/64,生物药品发展,第三代生物药品：应用,生物工程技术生产,天然生理活性物质，以及经过,蛋白质工程原理设计制造,含有比天然物质更高活性类似物，或与天然物质结构不一样全新药理活性成份。,重组人生长激素、重组人胰岛素、重组人干扰素,1b、重组人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素（EPO）等,生化药品,生物合成药品,生物制品,生物药品分类,5/64,生物药品分类,生化药品:,普通系指从动物、植物及微生物提取，也可用生物-化学半合成或用当代生物技术制得,生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等,，如,氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、脂质、核苷酸类,等。,生物合成药品:,由,微生物代谢,所产生药品和必须利用,微生物及其酶转化反应,共同完成半合成药品，如山梨醇、木糖醇、甘露醇、枸橼酸、,氨基酸、维生素、生物碱、甾体激素、抗生素,和一些核苷酸、酶与辅酶类药品等。,6/64,生物药品分类,生物制品:,以,微生物、细胞、动物或人源组织和体液,等为原料，应用传统技术或当代生物技术制成，用于人类疾病预防、治疗和诊疗。,生长激素释放抑制激素生产：,10万只羊下丘脑,1mg,10L大肠杆菌工程菌株发酵液,核酸疫苗制备技术路线：,目标抗原基因选择与分离,与载体DNA连接转入宿主扩增质粒重组质粒提取,、纯化与后处理,7/64,二、生物制品种类与特点,疫苗类药品,细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗和类毒素,抗毒素及抗血清类药品,破伤风抗毒素等,血液制品,人血白蛋白、人免疫球蛋白、人纤维蛋白原,生物技术制品,重组人表皮生长因子凝胶（酵母）、重组人p53腺病毒、基因工程乙肝疫苗、单克隆抗体等,微生态活菌制品,如双歧杆菌活菌胶囊、地衣芽孢杆菌活菌颗粒、酪酸梭菌活菌片等,诊疗制品,体外诊疗制品（HBsAg酶联免疫诊疗试剂盒）、体内诊疗试剂,8/64,二、生物制品种类与特点,分子量不定值不一样相对分子质量产生不一样活性,生化法结构确证定时监测制品肽图,需检验生物活性生物检定法证实活性,安全性检验宿主蛋白残留量，提取溶剂残留量,效价测定酶活力测定,9/64,三、生物制品全程质量控制,注射用重组链激酶产品全程质量控制过程,操作过程,详细项目,法定标准,1 基本要求,生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等,符合“凡例”相关要求,2 制造,2.1 工程菌菌种,名称与起源,带有链激酶基因重组质粒转化大肠杆菌菌株,种子批建立、菌种检定,应符合要求,2.2 原液,种子液制备、发酵用培养基,应符合要求,种子液接种及发酵培养,按工艺操作,发酵液处理、初步纯化、高度纯化,按工艺操作，纯度符合要求,原液检定,按3.1项进行,2.3 半成品,配制与除菌、半成品检定,工艺按要求操作，检定按3.2项进行,2.4 成品,分批、分装与冻干、规格、包装,应符合要求,10/64,3 检定,3.1 原液检定,生物学活性、蛋白质含量、比活性,依法测定，应符合要求,纯度,电泳法、HPLC测定，纯度不低于95.0,分子量,还原型SDS-PAGE法测定，为47.0,4.70kD,外源性DNA、宿主菌蛋白残留量以及残留抗生素,依法测定，应符合要求,细菌内毒素,依法测定，应符合要求,等电点,主区带应为4.6,5.6,紫外光谱扫描,最大吸收波长应为277,3nm,肽图,依法测定，应与对照品图形一致,N-末端氨基酸序列,Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp,3.2 半成品检定,细菌内毒素、无菌检验,依法测定，应符合要求,3.3 成品检定,判别试验、物理检验、化学检定,依法测定，应符合要求,生物学活性,应为标示量80150,无菌、细菌内毒素、异常毒性检验,依法测定，应符合要求,11/64,对生物制品质量控制重点,有效成份同一性、结构确证；,有效成份均一性、纯度检验；,有害物质及残余杂质（特殊杂质）等控制；,高效、灵敏生物活性及比活性等试验方法。,为了正确反应生物制品性质与特征，生物制品质量控制基本方法普通应包含判别试验、杂质检验、安全性检验和含量（生物学活性或效价）测定。,12/64,第二节 判别试验,依据生物制品化学结构、理化性质和生物学特点，利用,化学法、物理法及生物学方法,进行一些,特殊反应,，或测定一些,专属理化常数,如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，来判断与确证产品真伪。,需要标准品或对照品在同一条件下进行对照试验。,生物制品判别不是由一项试验就能完成，而是依据其特异分子结构和(或)其它特征(包含理化性质和生物学活性等),设计一组试验来全方面评价一个药品,。,13/64,一、理化判别法,化学法：,通常利用药品与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色产物或沉淀进行判别。,蛋白质类生物制品蛋白质变性反应,胰蛋白酶+对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐,紫色,胃蛋白酶+鞣酸、没食子酸或多数重金属盐溶液,沉淀,紫外分光光度法：,蛋白质类生物制品紫外吸收光谱是因为芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸光吸收结果。,对于一个蛋白或多肽分子来说，它最大吸收波长是固定，不一样批次产品紫外光谱图也应该是一致。,14/64,一、理化判别法,高效液相色谱法：,基于生物制品供试品溶液和对照品溶液色谱图中,主峰保留时间和肽图一致性,，,可用于目标产品判别。,重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经胰蛋白酶裂解后RP-HPLC（左）和CZE（右）肽图经典谱图,15/64,一、理化判别法,示例：,胰岛素判别,（1）在含量测定项下统计色谱图中，供试品溶液主峰保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致。,（2）取本品适量，用0.1三氟醋酸溶液制成每lml中含10mg溶液，取20,l,，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.3)20,l,、0.1V8酶溶液20,l,与水140,l,，混匀，置37水浴2小时后，加磷酸3,l,，作为供试品溶液；另取胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。,16/64,一、理化判别法,照含量测定项下色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90:10)为流动相A，乙腈-水(50:50)为流动相B，按右表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶液各25l，分别注入液相色谱仪，统计色谱图，供试品溶液肽图谱应与对照品溶液肽图谱一致。,时间,（分钟）,流动相A（%）,流动相B（%）,0,90,10,60,55,45,70,55,45,17/64,二、生化判别法,酶法：,利用酶对底物特异性催化活力，能够作为酶类生物制品简便、快速、灵敏判别方法。,尿激酶判别：,尿激酶,用巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8)溶解 成1ml(含20单位),+,牛纤维蛋白原,溶液0.3ml 再依次加入,牛纤维蛋白溶酶原,溶液0.2ml，,牛凝血酶,溶液0.2ml，快速摇匀，马上置,37,0.5恒温水浴,中保温，记时，反应系统应在,30s,45s内凝结，且凝块在15min内重新溶解。,以0.9氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2h内不溶。,18/64,二、生化判别法,电泳法：,应用电泳技术如等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等，,取得目标产品一致性、同一性电泳图谱和数据，,可用于蛋白质类生物制品判别。,等电聚焦电泳用于检测蛋白质类生物制品等电点，比如中国药典年版三部收载重组人干扰素,1b、,2a、,2b和,等电点，依法测定，主区带应分别为4.0,6.5、5.5,6.8、4.0,6.7和8.1,9.1。,19/64,二、生化判别法,示例：,重组人生长激素判别,取本品，加水溶解制成每1ml中含1mg溶液，取此溶液90l，加两性电解质10l和甲基红试液2l，混匀，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品，同法制备，作为对照品溶液。取对照品溶液和供试品溶液各10l，加至上样孔，照等电聚焦电泳法（附录 F第六法）试验，供试品溶液主带位置应与对照品溶液主带位置一致。,20/64,三、生物判别法,血清学法,体外抗原抗体试验。抗原抗体反应含有高度特异性，只要一方已知，即可检测出另一方。如,凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应，,以上四种类型反应即所谓经典血清学反应。,21/64,三、生物判别法,示例：,人血白蛋白判别,采取免疫双扩散技术，依法测定（附录 C），供试品仅与抗人血清产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊血清不产生沉淀线。选择免疫电泳技术，依法测定（附录 D），供试品与正常人血清比较，主要沉淀线应为白蛋白。,22/64,三、生物判别法,生物学法,利用生物体对生物制品特定生物活性反应为基础进行供试品判别即为生物学法。,23/64,三、生物判别法,示例：,注射用重组人促红素（CHO细胞）,人促红素含有刺激网织红细胞生成生物作用。给小鼠皮下注射供试品后，其血液中网织红细胞数量伴随人促红素注射量增加而升高。所以，中国药典年版三部收载注射用重组人促红素（CHO细胞），其原液检定依据人促红素独特生物学活性，即采取网织红细胞法。,24/64,第三节 杂质检验,生物制品杂质检验可用来判定产品优劣。普通地，只要在不影响临床疗效及人体健康标准下，药品质量标准能够允许生产过程和贮藏过程中引入微量杂质存在。,生物制品来自生物体，生物活性特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构经常不确定，有时产品成份并非单一，,极微量杂质可能产生显著效应，,所以，生物制品杂质检验就显得尤为主要，包括项目也各有特点，主要包含普通杂质检验、特殊杂质检验和安全性检验。,25/64,一、特殊杂质检验,特殊杂质是指药品在生产和贮藏过程中可能引入特有杂质。,特殊杂质检验意义是特殊杂质可能存在毒性会引发安全性问题；可能影响产品生物学活性和药理作用，或使产品变质；也反应产品生产工艺稳定性。,生物污染物微生物、外源性DNA等,产品相关杂质二聚体，多聚体，突变物等,工艺添加剂残余抗生素，甲醛，吐温80，曲拉通X-114等,26/64,（一）宿主细胞（菌）蛋白残留量,中国药典年版均采取酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA),ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。,酶标板固相,兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体,加入供试品,菌体蛋白与抗体结合,洗涤,加入辣根过氧化酶标识抗体,加入专一性底物，反应后测定492nm吸光度值,菌体蛋白含量,27/64,示例：,ELISA法检测大肠杆菌表示系统生产重组制品中残留菌体蛋白含量,ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标识抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶活性。,1、在测定时，受检标本(测定其中残留菌体蛋白抗原)与固相载体表面兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体起反应；,2、经过洗涤使固相载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分开；,3、加入辣根过氧化酶(HRP)标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，也形成抗原抗体复合物而结合在固相载体上。,28/64,示例：,ELISA法检测大肠杆菌表示系统生产重组制品中残留菌体蛋白含量,4、所以，固相上酶量与标本中受检物质量呈一定百分比；,5、加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关；,6、故可依据呈色深浅进行定性或定量分析。,因为酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应结果，使宿主细胞（菌）残留蛋白测定方法到达很高敏感度，以确保生物制品安全有效。,29/64,详细操作：,取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含l0,g溶液，以100,l/孔加至96孔酶标板内，,4放置过夜(16h,18h),。用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备1牛血清白蛋白溶液，以200,l孔加至板内，37放置2h；将,封闭好酶标板,用洗涤液洗板3次；以100,1孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做,双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液),，37放置2h；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标识兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000倍，以100,1孔加至板内，37放置1h，用,洗涤液洗板10次,，以100,1孔加入底物液，37避光放置40min，以50,l孔,加入终止液终止反应,。用酶标仪在492nm波优点测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。,以标准品溶液吸光度对对应浓度作,标准曲线,，并以供试品溶液吸光度在标准曲线上得到对应菌体蛋白含量。,30/64,（二）外源性DNA残留量,伴随生物技术发展以及人们对细菌、病毒和细胞长久研究与不停认识，制造生物制品宿主细胞（菌）残留DNA（外源性DNA）安全性问题逐步清楚，,大样本、长时间临床试验深入证实生物制品中外源DNA不应该视为一个潜在危险原因，,而是作为生物制品中一个不纯、应该去掉杂质成份来对待，为此相关外源性DNA限量要求也随之放宽。,外源性DNA测定方法当前主要有三种，即,分子杂交（Hybridization）技术,、,基于DNA结合蛋白(Threshold)分析系统,和,实时定量PCR（Q-PCR）方法,。,31/64,生物制品中外源性DNA残留检测方法比较,Hybridization,Threshold,Q-PCR,特异性,物种特异性,无特异性,序列特异性,检测最小序列长度(bp),50,600,150,抗干扰性和稳定性,+,+,+,所需时间（h）,48,6,2,灵敏度（pg）,10,6,30,560000,32/64,（三）产品相关杂质,产品相关杂质是生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保留过程中产生与产品结构类似同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体和降解产物等。,产品相关杂质在生物制品中可能被认为是活性成份，而且经验表明许多产品相关杂质是均匀和非免疫原性，但因为生物效应没有经过严格安全性试验研究，应制订允许程度加以控制。,惯用分离测定方法有高效液相色谱法和电泳法。,33/64,示例：重组人生长激素产品中高分子蛋白质,取本品适量，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）制成每1ml中含重组人生长激素1.0mg溶液，作为供试品溶液；另取重组人生长激素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。,照,分子排阻色谱法测定,，以适合分离,分子量为5000,60000球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂,；异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液调整pH值至7.0，加水至1000ml）（397）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为214nm。,34/64,取重组人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取0.063 mol/L 磷酸盐缓冲液12.5）制成每1ml中含1.0mg溶液，取20l注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体分离度应符合要求。,取供试品溶液20l注入液相色谱仪，统计色谱图，按,面积归一化法计算，高分子蛋白质含量不得过4.0%。,35/64,（四）残余抗生素,对于生物制品制造工艺，标准上不主张使用抗生素。,比如中国药典年版三部收载注射用重组人干扰素,2a（酵母）和注射用重组人促红素（CHO细胞）产品生产各个步骤均严格限制抗生素使用，故产品检定包含原液、半成品、成品无须检验残余抗生素活性。,假如生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不但要在纯化工艺中去除，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性检测项目。,依据中国药典年版三部附录A抗生素残留量检验法能够检测残余氨苄西林或四环素活性。,该法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物抑制作用，比较对照品与供试品对接种试验菌产生抑菌圈大小，,检验供试品中氨苄西林或四环素残留量。,36/64,二、安全性检验,来自生物体生物制品因为本身独特大分子结构、高效生物活性以及制造、纯化、贮藏过程带来潜在危险原因，使安全性检验成为生物制品质量标准中一个必不可少检验项目，是确保临床用药安全、有效主要指标。中国药典(年版)对于生物制品安全性检验主要项目包含以下几个方面：,无菌检验法、热原检验、细菌内毒素检验、异常毒性检验法、支原体检验法、病毒外源因子检验法、微生物检验法和鼠源性病毒检验法。,37/64,第四节 含量（效价）测定,理化分析法、生化测定法和生物检定法,定量表征生物制品方法通常有两种：,用百分含量表示,，适合用于成份已知、结构明确生物制品,用生物效价或酶活力单位表示,，适合用于大多数酶类和蛋白质类生物制品,38/64,一、理化分析法,滴定法：,示例：,胰酶中胰淀粉酶测定,利用氧化还原反应，,以1可溶性淀粉溶液为底物，经胰淀粉酶水解后产生还原糖，,在碱性溶液中过量碘滴定液氧化生成还原糖，而剩下碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液滴定至无色。依据每1ml碘滴定液（0.05 mol/L）相当于9.008mg无水葡萄糖滴定度来推算还原糖含量，进而求得每1g胰酶中含胰淀粉酶活力（单位）。,39/64,一、理化分析法,光谱法：,蛋白质制品含量测定，既能够依据在,280nm,左右有最大吸收直接测定，也能够利用,蛋白质与双缩脲试剂发生颜色反应,而进行含量测定，选择依据取决于测定方法专属性、稳定性和简便性。,中国药典年版二部收载胰蛋白酶效价测定是基于酶活力选择性和底物产物光谱特征，即依据胰蛋白酶与底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯作用后生成产物在253nm处吸收度值改变来进行胰蛋白酶效价测定。,40/64,一、理化分析法,高效液相色谱法：,反相高效液相色谱法,测定重组人胰岛素含量,取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液定量稀释至每1ml中约含10单位溶液（临用新配）。精密量取20,l注入液相色谱仪，统计色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以人胰岛素峰面积计算，即得。,41/64,分子排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）,也称凝胶色谱法（gel chromatography），是快速分离不一样分子量混合物色谱方法，广泛应用于多肽和蛋白质等生物制品分离分析及其分子量测定。,分子排阻色谱柱惯用固定相是,亲水性有机凝胶,（如葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅胶或改性硅胶，流动相是能够溶解样品低黏度缓冲溶液或有机溶剂-缓冲液混合溶液等。,42/64,分子排阻法应用特点,（1）生物活性蛋白质能够回收制备。,（2）色谱分离是在固定百分比水溶液体系中进行。,（3）色谱分离是依据蛋白质或多肽在溶液中对应有效粒径而进行。,（4）分子排阻色谱法峰容量有限，在整个色谱图上普通只能容纳10,12个色谱峰，分离度低。,43/64,一、理化分析法,示例：,分子排阻色谱法测定重组人生长激素含量,1、照分子排阻色谱法测定，以适合分离分子量为5000,60 000球状蛋白色谱用亲水硅胶为填充剂；以异丙醇-0.063mol/L磷酸盐缓冲液（无水磷酸氢二钠5.18g，磷酸二氢钠3.65g，加水950ml，用85%磷酸溶液调整pH值至7.0，加水至1000ml）（397）为流动相；流速为每分钟0.6ml；检测波长为214nm。,44/64,一、理化分析法,2、取人生长激素单体与二聚体混合物对照品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）（取0.063mol/L磷酸盐缓冲液12.5）制成每1ml中含1.0mg溶液，取20l注入液相色谱仪，重组人生长激素单体与二聚体分离度应符合要求。,3、取本品，用0.025mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）溶解并定量稀释制成每1ml中含1.0mg溶液，精密量取20l注入色谱仪，统计色谱图；另取重组人生长激素对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。,45/64,二、生化分析法,（一）电泳法,醋酸纤维素薄膜电泳法,琼脂糖凝胶电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,毛细管电泳法,46/64,示例：重组人胰岛素及其相关物质毛细管区带电泳分析,亲水性多肽、蛋白质成份在反相色谱柱上保留较差，且疏水性相同或相近多肽、蛋白质成份采取普通RP-HPLC条件不易分离,电泳条件 石英毛细管柱(Beckman)75,m 57 cm，有效长度50 cm；电极缓冲液 0.05 mol/L 醋酸钠-0.85 mol/L 2-环己胺基乙磺酸-10%乙腈。每次进样前，依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、电极缓冲液清洗毛细管柱3 min；压力进样6 s，进样后再进5 s电极缓冲液；分离电压16 kV；检测波长214 nm，柱温30。在上述电泳条件下进行对照品溶液、供试品溶液CZE法分析。,47/64,重组人胰岛素及其相关物质毛细管区带电泳分析经典谱图,1.苯酚,2.重组人胰岛素,3.相关物质,注射剂样品测定结果（标示量，n=3）,注射剂批号,CZE法（RSD%）,RP-HPLC法（RSD%）,970522,98.1（0.76）,97.4（0.42）,970530,97.6（0.72）,97.6（0.22）,970630,98.1（0.36）,98.1（0.33）,48/64,（二）酶分析法,以酶为分析对象，目标在于测定样品中某种酶含量或活性“酶活力测定”,以酶为分析工具或分析试剂，主要用以测定样品中酶以外其它物质含量“酶法分析”,以酶能专一而高效地催化某化学反应为基础，经过对酶反应速度测定或对底物、生成物等浓度测定而检测对应物质含量。,49/64,酶反应速度能够用单位时间反应底物降低或产物增加来表示，酶反应速度愈快则表示酶活力愈高。,酶活性单位（国际单位IU）,：是指在25下，以最适宜底物浓度、最适宜缓冲液离子强度以及最适宜pH值诸条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物酶量定为一个活性单位。酶比活性即定为一毫克酶活性单位。,酶促反应条件：,底物、pH值、温度、辅助因子、空白和对照、线性关系,酶活力测定方法：,取样测定法、连续测定法（紫外光谱法、荧光分析法、旋光度法）,50/64,示例：胃蛋白酶效价测定,胃蛋白酶,催化血红蛋白,水解生成不被三氯醋酸所沉淀氨基酸。利用胃蛋白酶催化特征和水解产物中,芳香氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸紫外吸收光谱,，能够进行胃蛋白酶效价测定。,测定法 取试管6支，其中3支各精密加入,对照品,溶液1ml，另3支各精密加入,供试品,溶液1ml，置370.5,水浴,中，保温5分钟，,精密加入,预热至370.5,血红蛋白试液,5ml，摇匀，并准确计时，在370.5水浴中反应,10分钟,，,马上精密加入5%三氯醋酸溶液5ml,，摇匀，滤过，,取续滤液备用。,51/64,另取试管2支，,各精密加入血红蛋白试液5ml,，置370.5 水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，,其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，,摇匀，滤过，取续滤液，,分别作为供试品和对照品空白对照,，照紫外-可见分光光度法，在275nm波优点测定吸光度,每1g 含蛋白酶活力（单位）=（,A,Ws,n）/（,As,W,10,181.19）,式中,As为对照品平均吸光度；,A为供试品平均吸光度；Ws为每1ml对照品溶液中含酪氨酸量（,g）；W为供试品取样量（g）；n为供试品稀释倍数；181.19为酪氨酸分子量。,52/64,示例：胰蛋白酶效价测定,胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸羧基组成肽键、酰胺键及酯键，其水解速率为酯键酰胺键肽键。,中国药典版二部对于胰蛋白酶效价测定采取专属性较高,N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐,作为底物。,53/64,测定法 取,底物溶液,3.0ml与 0.001mol/L盐酸溶液 200,l，混匀，作为空白。,另取,供试品溶液,200,l，加底物溶液（恒温于25.00.5）3.0m1，马上计时，混匀，,使比色池内温度保持在250.5，,照紫外-可见分光光度法，在253nm波优点，,每隔30秒钟读取吸光度，共5分钟。,以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，作图；,每30秒钟吸光度改变应恒定在0.015,0.018之间,，呈线性关系时间不得少于3分钟。若不符合上述要求，应调整供试品溶液浓度，再作测定。,54/64,P=（A1-A2）/（0.003TW）,式中 P为每1mg供试品中含胰蛋白酶量（单位）；,A1为直线上终止吸光度；,A2为直线上开始吸光度；,T为A1至A2读数时间（分）；,W为测定液中含供试品量（mg）；,0.003为在上述条件下，吸光度每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。,55/64,三、生物检定法,生物检定法是利用药品对生物体或其离体器官组织等所起药理作用来检定药品效价或生物活性方法，用于无适当理化方法进行检定药品。,生物检定法包含整体和离体测定。,56/64,基本概念,生物检定标准品,凡中国药典要求用生物检定品种都有它生物检定标准品（S）。,质反应,观察某一反应或反应某一特定程度出现是否，只有出现与不出现两种情况，不能用量来表示个体反应程度，只能用一组动物中出现正（或负）反应百分率来表示，如死亡率、惊厥率，这类生物反应称为质反应。,57/64,基本概念,量反应,药品作用于生物体所引发生物学反应伴随药品剂量增加而产生量变，表现为剂量与药效存在着一定数量关系，称为生物反应中量反应。,等反应剂量比,生物检定是将供试品（T）和其生物检定标准品（S）在相同试验条件下同时对生物体或其离体器官组织等作用进行比较，经过对比，计算出它们等反应剂量比值（R），以测得供试品（T）效价P,T,。其中等反应剂量比值（R）是生物检定标准品（S）和供试品（T）等反应剂量（,d,S,、,d,T,）比值，即R=,d,S,/,d,T,。,58/64,示例：重组链激酶生物学活性测定法,依据链激酶和纤溶酶原形成复合物能激活游离纤溶酶原为有生物学活性纤溶酶，纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性纤维蛋白片段，在纤维蛋白平板上出现透明溶解圈，以此测定重组链激酶生物学活性。,试剂：人凝血酶溶液、人纤溶酶原溶液、人纤维蛋白原溶液,59/64,测定法,取琼脂糖125mg，加生理氯化钠溶液23ml，煮沸使之溶胀，置55,60水浴中平衡，加每1ml含100IU,人凝血酶溶液,14l，,人纤溶酶原溶液,（每1ml含0.5mg）280l，边加边摇匀，加每1ml含6mg人纤维蛋白原溶液2.2ml，不停摇匀，浑浊后马上倒入直径8cm平皿中，水平放置充分凝固后，4放置最少30分钟待用（应在两天内使用）。在含纤维蛋白平皿内打孔，孔径为2mm，在孔内分别加入供试品溶液和标准品溶液，每孔10l，每个稀释度做两个孔，37湿盒水平放置24小时。,纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀释度生物学活性对数为横坐标，以溶圈直径对数为纵坐标，按生物统计学分析结果，并求得线性回归方程，依据供试品溶圈直径对数求得供试品生物学活性。,60/64,因为生物学差异存在，生物检定法结果误差较大，重现性也较差，且操作繁琐、测定费时等，所以，,当前生物检定法主要用于无适当理化方法或生化方法进行检定生物制品药品，以填补理化分析和生化分析不足。,伴随当代分析技术和生物检测技术发展，生物制品质量研究将会得到深入加强和提升，有效理化分析与生化分析方法将越来越多地成为生物制品质量控制首选方法。,61/64,小 结,第一节 概述,一、生物药品与生物制品,二、生物制品种类和特点,第二节 判别试验,一、,理化判别法：化学反应法、紫外分光光度法、液相色谱法,二、,生化判别法：酶法、电泳法,三、生物判别法,第三节 杂质检验,一、,特殊杂质检验,二、安全性检验,第四节 含量（效价）测定,一、,理化分析法：滴定法、光谱法、高效液相色谱法,二、,生化分析法：电泳法、酶分析法,三、生物检定法,62/64,经典文件研读,1梁成罡，毛 歆，沈 舒，等.重组人促卵泡激素(rhFSH)制剂SDS-PAGE/Western blot判别方法研究.药品分析杂志，,29（10）：1611-1614.,2石劲敏，金 方.RP-HPLC法测定鼻用重组人胰岛素粉雾剂中相关蛋白质.中国医药工业杂志，,40（7）：532-535.,3.李 晶，梁成罡，张 惠，等.重组甘精胰岛素相关杂质结构确认及质量分析.中国药学杂志，43（20）：1588-1592.,4.李永红，张勇朝，袁力勇，等.重组 hPK-5质粒 DNA基因治疗制剂质量标准研究.药品分析杂志，,28（5）：661-666.,5.曾文珊，廖海明，杨仲元，等.肽图分析在重组人甲状旁腺素 1-34产品质量控制中应用.中国药学杂志，41（13）：1020-1022.,6曾文珊，刘景晶，徐康森.重组人甲状旁腺素 1-34分子量测定方法研究.药品生物技术，,13（4）：286-289.,7.孔 婧，凤 姣，范 豪，等.重组人甲状旁腺素 rh-PTH(1-34)结构类似物纯度质量研究.药品分析杂志，,30（5）：863-867.,63/64,练习,思索题,研读中国药典版三部收载生物制品注射用重组链激酶质量标准,64/64,