APC基因与结直肠肿瘤.pdf

ture.Ann-Chir,1999,53(10):1 029-1 032.7 Camunez F,Echenagusia A,Simo G,et al.Malignant col-orectal obstruction treated by means of self-expandingmetallic stents:effectiveness before surgery and in pallia-tion.Radiology,2000,216(2):492-497.8TschmelitschJ,WykypielH,PrommeggerR,etal.Colostomy vs tube cecostomy for protection of a lowanastomosis in rectalcancer.Arch Surg,1999,134:12,1385-1 388.9 Dudley HAF,Radcliffe AG,Mc Geehan D.Intraoperativeirrigation of the colon to permit primary anastomosis.Br JSurg,1980,67:80-18.10 Runkel NS,Hinz U,Lehnert T,et al.Improved outcomeafter emergency surgery of the large intestine.Br JSurg,1998,85:1 260-1 265.11 Chiappa A,Zbar A,Biella F,et al.One-stage resectionand primary anastomosis following acute obstruction ofthe left colon for cancer.Am Surg,2000,66(7):619-622.12Hsu TC.One-stage resection and anastomosis for acuteobstruction of the left colon.Dis Colon Rectum,1998,41:28-32.13 V.NaraynsinghR,RampaulD,MaharajT,etal.Prospective 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GS(Gardner综合征)患者进行细胞遗传学研究,发现其第 5号染色体长臂部分缺失。1987年,Bodmer和 Leppert各自经连锁分析把与 FAP发生有关的基因定位于 5q21-22。1991年,Joslyn2等发现 2例不相关的 FAP患者 DNA中 APC基因区域各有一小段缺失,而且小段缺失包含于大段缺失内,并发现该缺失区域内有3个新的基因,分别是 DR1、SRP19和 DP2.5。Gro-den 3和 Kinzler等4应用 PCR技术和特异 cDNA探针分析,确定 DP2.5基因即为 APC基因。2 APC基因及 APC蛋白的结构 APC基因位于染色体 5q21,其 cDNA克隆序列分析显示 1个 8 538个核苷酸组成的开放阅读框架4,含 15个外显子,其中 15外显子最大,为6571bp,占该基因编码区的 77%3。“突变密集区”(mutation cluster region,MCR)位于该外显子内5。该阅读框架 5端含有 1个甲硫氨酸密码子,其上游9bp处有一框内终止密码子,3端有数个框内终止密码子。APC基因编码一个 2 843个氨基酸组成的蛋白,即 APC蛋白,分子量约为 300 KD。Kinzler等的研究表明 APC蛋白与 M3毒蕈样乙酰胆碱样受体(mAchR)有同源序列4,Bourne认为该序列跟正常 APC蛋白抑制细胞过度增殖有关。APC蛋白有数个功能区域。前 17个氨基酸通过形成 -螺旋棒介导同源二聚体形成,截短 APC蛋白(truncated APC protein)可通过该区域与野生型56大肠肛门病外科杂志 2001年第 7卷第 2期APC蛋白联系。中间部分包含七价重复(heptad re-peat)、Arm重复(Armadillo repeat)、磷酸化位点和-Catenin结合部位6,7。Arm重复位于 435 766氨基酸中3,4,8,是高度保守的氨基酸序列,可能介导蛋白间的相互作用。-Catenin主要结合点位于 1020 1169氨基酸之间的 3个 15-氨基酸重复9,10。第二个-Catenin结合点位于 1342 2075残基之间,包含 7个 20-氨基酸重复片段,该结合位点受活化的 GSK-3 (glycogen synthase kinase-3)调节11。C-末端包含可降解-Catenin的部位16和结合细胞骨架微管的部位。APC蛋白 2 500 2 843氨基酸可结合 EB1(其功能末知)。APC最后的残基还可以结合 DLG抑癌基因蛋白(人同源的果蝇肿瘤抑制蛋白)。APC蛋白的结构如图 1所示。3 APC基因杂合性丢失(LOH)对大多数肿瘤而言,若其某一染色体某一位点上常发生杂合性丢失(loss of heterozygozity,LOH),那么该位点或其附近即可能存在着肿瘤抑制基因。在 FAP癌变患者中,5q21 22区域频发 LOH,支持APC基因属一种抑癌基因。APC基因 LOH在散发性结直肠癌中发生率为 35%45%,散发性结直肠腺瘤也伴 5q LOH,占 20%。Michiko等12报道 44%FAP癌和 23%非 PAP癌同时存在 APC突变和LOH,表明突变加 LOH使 APC失活在 FAP癌和非FAP癌发生中都有作用。4 APC基因在结直肠肿瘤中的突变 APC基因突变主要包括点突变和移码突变,前者包括无义突变、错义突变和拼接错误,后者包括缺失和插入5。4.1 生殖细胞突变 FAP中生殖细胞突变率报道不一。Miyoshi等用 RNA酶保护试验和序列分析技术分析 79例FAP患者 APC基因全部外显子,发现 53例有生殖细胞突变(67%),23例为点突变,其中 19例无义突变,4例错义突变;移码突变 30例,缺失 28例,插入 2例。Miyoki12用 PCR-SSCP、直接测序方法检测外显子 1 15 k,119例 FAP检出 68例有生殖细胞突变,其中 42例(62%)为 1 2 bp的缺失,6例(9%)为 1 4 bp插入,20例(29%)点突变。Beroud等总结分献报道的 332例生殖细胞突变,220例(66%)缺失,21例(8%)插入,6例(2%)错义突变,85例(26%)无义突变,存在 2处突变热点,密码子 1 061 1 063和密码子 1 309 1 311,约20%生殖细胞突变发生在该处。4.2 APC基因体细胞突变 Powell等13应用 PCR、DNA直接测序技术检测 APC基因全部编码区,41例散发性大肠肿瘤,其中结直肠癌 25例,腺瘤 16例,体细胞突变率分别为60%(15/25)、63%(10/16)。Miyoshi等 22也对大肠肿瘤 APC基因的体细胞突变进行研究,63例(12例 FAP、51例散发性大肠肿瘤)检测到 43例体细胞突变,结果与生殖细胞类似:点突变 49%、移码突变 51%,95%突变形成终止密码子。而在遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorec-tal cancer,HNPCC)病例中,APC基因突变率 20%14。在 FAP或非 RAP中,APC基因体细胞突变主要集中于外显子 15的 5 端前半部,密码子 1286 1 513之间 10%左右编码区集中了约 65%的体细胞突变,被称为“突变密集区”(mutation clusterregion,MCR)5。散发性结直肠癌 MCR区域体细胞突变率为 28 41%。5 APC基因突变与临床病理因素的关系5.1 家族性腺瘤性息肉病(FAP)FAP是一种少见的常染色体显性遗传病,因APC基因生殖细胞突变引起,几乎是完全显性遗传病,约占结直肠癌发病率 1%。本病特征是发病年龄不一致,于 20 30岁形成数百至数千个结直肠腺瘤,具有很高的癌症发生率,如不予治疗,几乎都将发展成为结直肠癌,比散发性结直肠癌预期发病年龄约早 20年。另外,病人常出现结肠外表现,包括先天性视网膜色素上皮肥大症、十二指肠腺瘤、胃腺瘤、纤维瘤、骨瘤、脑肿瘤和内分泌异常。大约 20%FAP病人无本病家族史,这些病人被认为是携带有APC基因自发的、新的生殖细胞突变。FAP有力支持 Knudson的“二次打击”学说。临床上,FAP发生多发病灶比预期时间早,符合靶器官每个细胞存在遗传突变的模式。体细胞另一等位基因是肿瘤发生的限速因子,它的失活可发生于任何体细胞。APC基因两个等位基因失活,在早期发现的病灶中就存在,包括 1mm的小腺瘤和异常腺管灶(aberrant crypt foci,ACF)15。研究人员已经发现 FAP的几个表现型,并报道APC基因特定部位的突变与 FAP特定的表现型相关。疏散型 FAP以发病年龄晚、结直肠腺瘤数目少为特征。在疏散型 FAP家系中,APC基因生殖细胞突变集中于氨基末端,通常在前 157个氨基酸33。丛57大肠肛门病外科杂志 2001年第 7卷第 2期密型 FAP病人则表现为进展型息肉病(多于 5000个结直肠腺瘤性息肉)。有进展表现型的 FAP家系的 APC基因生殖细胞突变主要位于 MCR区域。在与 FAP有关的结肠外表现中,先天性视网膜色素上皮肥大症与密码子 463 1 387之间的突变有关。Gardner综合征具有 FAP的胃肠道特点,其胃肠道外的表现则更加突出且变化多端。密码子 1 403 1 578之间的截短突变与 Gardner综合征有关,但有这些突变的病人不会出现先天性视网膜色素上皮肥大症。尽管 FAP不同表现型的突变往往集中于 APC基因特定部位,但相同的突变常常与不同的表现型有关,甚至在同一家系不同个体中也是如些。例如Giardiello等报道在密码子 1309具有相同突变的 11个无关的 FAP家系中,结肠息肉数目(3.8 13.1/cm2)、结直肠癌诊断年龄(19 62岁)以及具有结肠外表现病人的百分率(0%100%)都有较大差别。这些表现型差异是由于环境影响还是由于其他基因改变引起,尚不明了。5.2 散发性结直肠肿瘤 APC基因突变与散发性结直肠肿瘤的病理类型、临床分期及预后关系不十分清楚。Dix随访 100例 Dukes B、C期大肠癌患者,发现手术切除标本APC、P53、DCC以及 MCC等多基因突变与 Dukes分期及患者术后 3年生存率均无明显关联性。6 APC基因、APC蛋白的功能6.1 APC基因是一个抑癌基因许多证据表明 APC基因是一个抑癌基因。在FAP病人中存在 APC基因生殖细胞突变,而在结肠癌细胞中接着发生另一个等位基因的缺失或体细胞突变。在散发性结直肠肿瘤中,也常常发现两个等位基因的失活。超过 90%的 APC基因突变导致该基因失活,使转录提前终止 13。多个研究表明,与 FAP有关的结肠外表现包括纤维瘤、十二指肠腺瘤、胃癌,另一等位基因也存在体细胞突变或缺失。另外,有人假设一些 APC基因突变以显性负效应方式(dominant negative manner)阻滞野生型 APC蛋白的功能,这样无需“第二次打击”即可引起肿瘤发生17。Tanaka等通过微细胞融合,向结肠癌细胞系内转导含有 5q21正常第 5号染色体,可逆转肿瘤的恶性表型,去除转导的第 5号染色体,该细胞系又恢复其恶性行为。Groden等44把野生型 APC基因转染入三株具有各自 APC突变特点的结直肠癌细胞系中,发现野性生型 APC基因能使肿瘤形态发生改变,某些肿瘤细胞生长速度减慢,并使裸鼠体内致瘤作用下降,表现出肿瘤抑制作用,说明野生型 APC基因可以改变结直肠癌细胞株的转化特性。6.2 APC是结直肠上皮细胞的看门基因6.2.1 结直肠肿瘤与看门基因看门基因通过诱导生长或促进死亡直接调节肿瘤生长。每一种细胞类型有一个或几个看门基因,一个看门基因的失活导致特定组织类型的癌。一旦看门基因失活,其他直接控制细胞分裂或死亡的基因加速突变,导致肿瘤很快进展。为什么 APC突变会导致结直肠的癌发生?遗传了 APC基因突变的患者,APC基因在全身各处都有表达,却未在其它器官发展为癌?APC基因是唯一一个在结肠上皮增殖中起看门作用的基因,它的失活是细胞增殖所必需的18。正常情况下,看门基因负责细胞更新时维持细胞总数目的恒定,确保组织受损等情况下细胞对环境的适应。看门基因突变导致细胞分裂和死亡的持续不平衡。相反在看门基因存在时,其它基因突变不会导致细胞生长持续受影响。支持 APC基因作为结肠上皮细胞增殖的看门基因的研究:鼠 APC基因两个等位基因的失活发生于鼠结肠肿瘤的较早期,病变较小,需要显微镜才能观察到。在人类,APC基因的突变失活在能检查到的最早期的肿瘤病灶中就已存在。这种病变,称为异常腺管灶(ACF),被认为是腺瘤的前体。其它与结直肠癌相关的基因在 APC之前发生突变会怎么样呢?那种突变不会有效地引起肿瘤发生。一个例子是 P53抑癌基因,在 78%的结直肠癌中存在遗传学的改变,但存在 P53基因生殖细胞突变的病人没有息肉发生,甚至也没有发生结直肠癌的高危险性。因此,已经清楚 P53基因在结直肠肿瘤发生机制中起作用,但也清楚它不可能和 APC基因一样突变时可引起大肠肿瘤的发生。6.2.2 APC基因作为看门基因的机制 APC基因是怎样发挥其看门作用呢?APC蛋白可通过诱导调亡发挥其看门作用。APC蛋白是胞浆蛋白,明显位于结直肠上皮细胞基底膜侧,当细胞迁移至隐窝柱表面时 APC表达更为显著。在结直肠上皮细胞中,野生型 APC的表达伴有 APC突变可导致调亡,揭示 APC基因可控制细胞的死亡过程 19。没能这种“死亡信号”,细胞更新所需的精确平衡就会受到破坏。58大肠肛门病外科杂志 2001年第 7卷第 2期 APC基因的基本序列不能阐明其功能,与 APC蛋白作用的蛋白却提供了有益的线索。EB1、DLG可与 APC蛋白 C末端结合。几乎所有的 APC突变导致 APC蛋白 C末端丢失,表明 DLG和/或 EB1可能对 APC控制生长功能是必需的。然而,APC与-Catenin相互作用的研究最能阐明 APC的功能。APC中间 1/3有 2个-Catenin结合部分,其中一个通过磷酸化调节20。尽管许多突变 APC蛋白还保留-Catenin结合点,实际上所有突变 APC蛋白至少缺乏一类-Catenin结合的重复序列。APC和-Catenin结合与两个明显分开的细胞进程有关。第一个是细胞粘附。Catenin最初被确定为一组结合 Cadherin的胞浆蛋白,而 Cadherin是依赖 Ca2+的细胞表面粘附作用所必需的。如果-Catenin与 Cadhorin或 APC结合是特异的,那么APC调节粘附功能也是其看门功能的一部分。另外APC能作为粘附状态的下游信号传导者,使 Cad-herin-Catenin复合物与其他细胞成分联系。第二个进程涉及“APC-Catenin-Tcf-MYC”途径。“腺瘤k 癌”顺序被认为是大部分结直肠癌的中心环节,其早期事件是 APC基因突变3。而“APC-Catenin-Tcf-MYC”途径与“腺瘤-癌”顺序有类 21。APC是一种胞浆蛋白,能和-Catenin结合,并通过 GSK-3 促进-Catenin磷酸化 20,导致-Catenin通过普遍依赖的蛋白水解作用而降解,从而调节胞内-Catenin水平。APC突变可引起胞内-Catenin水平异常,而-Catenin发生突变,APC也不能调节-Catenin水平,导致-Catenin积聚。-Catenin能与转录因子 Tcf-4(T cell factor)结合,促进基因转录,而APC与-Catenin结合可抑制-Catenin/Tcf介导的转录22。据此,APC或-Catenin的突变会导致-Catenin/Tcf介导的转录活性增强 22。C-MYC是-Catenin/Tcf下游的靶基因,C-MYC的表达可被野生型 APC抑制,被-Catenin激活,这些效应是通过C-MYC启动子上 Tcf-4结合位点介导的23。这样,APC功能丧失可导致 C-MYC转录活性失控,从而可能致癌。6.3 APC基因其他功能 APC蛋白通过调节 cyclin-CDK(cyclin-cyclin-dependent kinase)复合物的活性,可能也在调节细胞周期中起作用。APC蛋白过度表达会阻止细胞从G0、G1期进入 S期,这种功能可被 Cyclin E-CDK2或Cyclin D1-CDK4消除24。尽管 APC蛋白能调节 Cy-clin-CDK复合物,但 APC蛋白介导的细胞周期阻滞的途径和其它抑癌基因(如 P53、RB)蛋白产物的途径不同。APC蛋白还能通过与微管的相互作用调节细胞的迁移。7 结语总之,大部分结直肠肿瘤是由于 APC基因突变而引发,但 APC突变在生化水平的功能影响还知之甚少,而且 APC基因发挥抑癌作用的具体细节及机理尚不清楚认识,有待今后更为深入的研究与探索。图 1 APC蛋白的结构参考文献1 Herrera L,Kakati S,Gibas L,et al.Gardner syndromein a man with an interstitial deletion of 5q.Am J MedGenet,1986,25:473-476.2Bodmer w,Bailey C,Bodmer J,et al.Localization of thegene for familial adenomatous polyposis on chromosome 5.Nature,1987,328:614-614.3 Leppert M,Dobbs M,Scrambler P,et al.The gene forfamilial polyposis coli maps to the long arm of chromosome5.Science 1987,238:13411-3.4 Joslyn G,Carlson M,Thliveris A,et al.Identification ofdeletion mutations and three new genes at the familialpolyposis locus.Cell,1991,66:601-603.5 Groden J,Thliveris A,Samowitz W,et al.Indentifica-59大肠肛门病外科杂志 2001年第 7卷第 2期tion and characterization of the 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h内在膀胱尚未充盈、没有尿意时主动下床排尿,没有则开始热敷及做相应的理疗以促进排尿;术后肛内放消炎镇痛药双氯芬酸钠栓一枚以减轻术后疼痛。应用上述方法简单,安全,患者没有痛苦,减少了并发症的发生,提高了手术质量。60大肠肛门病外科杂志 2001年第 7卷第 2期