primer-6.0-引物设计教程.doc

primer 6.0 引物设计教程
首先，需要知道基因序列，如，我们要设计rat的 CK18 mRNA检测的引物，我们先到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 这个网站查找CK18 mRNA的基因序列，
首先选择Nucleotide 然后在搜索栏输入基因序列号（如果不知道基因序列号则输入 rat CK18）如图

然后点击搜索，就会出现rat CK18 mRNA的基因序列
基因序列号

现在，往下拉就会看到基因序列

将这个序列复制到primer 6.0中就可以进行引物设计，
我们先打开peimer 6.0

破解版打开会出现这个对话框，关闭即可
点击新建

将序列复制至这个对话框

点击 Add

点击这个图标

出现下面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，我一般不更改，也就是引物可以设计在整个序列，你也可查一下序列有几个区，一般引物应该跨两个区。

之后点击 primer Parameters

这里可以设置退火温度、引物长度、产物长度等，我一般只是更改产物长度，我一般设为100到300bp，因为如果产物太大，在染料法中会影响扩增效率，

之后点击 Search 之后出现下面对话框

点击OK 出现下面引物序列

这个时候引物设计完成，我们需要对引物进行验证，我一般到NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上验证，进去后点击最下面菜单中的BLAST
点击这个图标

点击这个图标

之后点击Primer-BLAST

将前引物复制到图中位置
在这输入前引物

将后引物复制（注复制前引物用 Copy Sense Primer，复制后引物用Copy Anti-sence Primer 点击右键即出现复制菜单）

后引物放到下图位置
在这输入后引物

之后将图中位置的homo sapiens 删除后输入rat

出现上图对话框时选择Rattus（taxid：10114）
之后点击Get Primers

点这里

这时会出现下图情况，因为服务器在国外，请耐心等待

之后出现

他能扩增很多大鼠基因，如CK18 产物为126bp，Ahsg 产物795bp，但是除了CK18 其他基因扩增是产物较大，而且有点突变，所以在PCR反应时这些东西是扩增不出来的，也就是说这个引物的特异性不错，在扩增时只会扩增出我们需要的CK18这个基因，所以这个引物我们就可以订出去，找公司合成。有的时候这样的引物也不一定就可以用，所以当我们收到合成好的引物后，可以做一下预实验，看这个引物是否真的可以用，在需要引物时我们也可以到文献中查找，一般发表在全球著名杂志中的外文文献里的引物都是可以用的，查找是要注意文献中用的是染料法还是探针法，探针法的引物在染料法种效果不佳，应该舍弃，选择染料法的引物。