细胞传代标准化步骤.doc

细胞传代标准化流程：

穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；

1、 取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、 将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、 点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、 在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml， 中培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、 用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、 加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、 待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离心管；（一个5ml枪头）
8、 1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、 弃上清，口擦酒精，烧口；
10、 加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。（一个1ml枪头）
11、 将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、 用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、 做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭