实体瘤组织单细胞悬液制备.docx

实体瘤组织单细胞悬液制备及培养方案
一、 单细胞悬液制备
(一) 仪器、材料及试剂
1. 仪器：
(1) CO2培养箱（调至37℃），离心机，水浴锅（37℃），血球计数板；
(2) 无菌器械：细胞培养瓶，50 ml离心管，平皿，吸管，移液管，纱布，200目/ 300目尼龙滤网，手术器械。
2. 材料：肿瘤造模成功的大鼠
3. 试剂：RPMI1640 培养基（含10%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液/PBS缓冲液，碘酒
附：Hank’s液配方：
KH2PO4 ：0.06g；NaCl：8.0g；NaHCO3：0.35g；KCl：0.4g；
Glucose：1.0g； Na2HPO4·H2O：0.06g；
加H2O定容至 1000 ml
注：Hank’s液可以高压灭菌，4℃下保存。
(二) 操作步骤
机械-胰酶消化法
1. 取材：制备实体瘤单细胞悬液，肿瘤取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，挑选活力较好的部位。将大鼠麻醉，置75%酒精泡3-5 min（时间不能过长，以免酒精从口和肛门浸入体内），固定后再用碘酒消毒腹部，带入超净台内解剖取肿瘤组织，置于平皿中。
2. 用Hank’s 液/PBS缓冲液洗涤三次，并剔除周围脂肪、结缔组织、血液等。
3. 用无菌眼科手术剪将肿瘤剪成小块（1-2 mm），再用Hank’s 液/PBS缓冲液洗涤三次，转移至50 ml 离心管中。
4. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40 min，每隔5 min轻轻振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5. 加入2-5 ml含血清培养基，以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6. 静置2-3 min，使未分散的组织块下沉，将悬液转移到新的离心管中。
7. 用200/300目尼龙网过滤悬液2次。
8. 将过滤后悬液1000 rpm，离心5-10 min，弃上清液。
9. 加入Hank’s液/PBS缓冲液5 ml，轻轻冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
10. 视细胞量加入l-2 ml培养液，血球计数板计数。
11. 将细胞调整到5×105 /ml左右，转移至25 ml细胞培养瓶中，37℃下培养。或者直接用作流式分析及其他分析。

二、 实体瘤组织中抗癌药物含量检测
1. 按上述取材步骤取出合适的肿瘤组织，分成A、B两份，分别置于含有1-2 ml PBS缓冲液的无菌离心管中（离心管及PBS液已称重），准确称量肿瘤组织的重量。A组可直接用于检测组织中抗癌药物的含量，B组用于检测细胞内抗癌药物含量。
2. B组组织按照上述步骤制成单细胞悬液，制备过程中，保留每一次的PBS洗液（1-2 ml），标记清楚，用于检查含药量。
3. 将单细胞悬液计数，统计细胞总量，检查细胞内抗癌药物含量。
三、 肿瘤细胞培养
(一) 肿瘤细胞培养
1. 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞多为贴壁细胞，将刚分散的细胞转移至培养瓶后，待4-5 h后观察细胞贴壁情况，此时可更换新的培养基，除去未能贴壁的细胞碎片及死细胞。
2. 每日观察细胞生长增殖情况，待细胞贴壁密度大于90%时，可用胰酶消化，按1:5比例进行传代到新的培养瓶或培养板上，可根据需要适当调整接种比例，或者取适量消化后进行其他细胞实验。
(二) 成纤维细胞的排除
成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
1. 机械刮除法：是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：
1) 标记：镜下观察，用记号笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；
2) 刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
3) 用Hanks液/PBS缓冲液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
4) 注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止
2. 反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
1) 待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks /PBS缓冲液冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
2) 取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；
3) 培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
4) 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3. 消化排除法：
1) 先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
2) 把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
4. 胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。
1) 可用0.5 mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
2) 用Hanks/PBS缓冲液洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。

四、 注意事项
(一) 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
(二) 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
(三) 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

四、 无菌操作的几个注意事项
(一) 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭。试剂等瓶口也要擦拭。
(二) 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
(三) 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
(四) 不能用手接触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
(五) 瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
(六) 吸溶液的吸管等不能混用。