丁香园---细菌保存方法.docx

一、 常用有以下方法：
1 半固体保存法 ：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，一般可以管3－6月
2 低温冻存法：接种菌落的肉汤加20％灭菌甘油，置－20或－70度，可存放一年以上。
3 真空冻干法：试最理想的保存方法，但需要特殊仪器。
二、我一般用甘油管保村法和冻干粉保存法
基因工程菌：
1：30%的灭菌甘油与培养好的菌悬液按照1：1的比例混合，分装到1.5ML的离心管中，每关1ML，存于--20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到——70度的低温冰箱中。
也可用10%的灭菌甘油从斜面上洗下保存。
2：菌悬液中加甘露醇和人血白蛋白
三、我们实验室保存菌种的方法是:
1 将菌落穿刺接种在半固体中，如加有琼脂的肉汤培养基，4度存放，保存时间较短一般3－4月
2 接种菌落的肉汤0.9ml加100％灭菌甘油0.1ml，置－20度冰箱中可以保存一年左右,－70度冰箱或液氮中可放置N年，细胞的保存我们放了近十年，仍然复苏的很好
3 基因工程菌的保存：
为防止基因工程菌质粒丢失或不稳定，保存菌种加入甘油的量应该不大于10%，一般0.9ml的菌液加0.1ml80％高压灭菌甘油－70度冰箱保存
四、
看见大家说了这么多的保存方法，我说一个我在实验室里自己用的方法：
将菌用LB培养过夜（该加什么如抗生素等别忘了哈），取14毫升（这个得根据你的离心机来定夺了）3000转离心，然后加3-4 毫升菌种保存液（甘油的量不多，5%而已，你也可以再加大一点）重悬，就行了。再用封口胶封一下，然后放在-20度里。我用这种方法保存的多种菌（包括基因工程菌），一年的时间里都还没有出过问题。
值得一提的是，你保存用的菌种管最好是新的，而且煮过最好，这样可以除去一些有机溶剂对菌的影响。
五、
对于一般的大肠杆菌等基因工程菌，我们室常用的方法是：
1、取原种100微升，在3ml适当培养基（2*YT，LB等），加好抗生素，37度摇菌过夜；
2、次日取50%甘油（已高压）与培养的菌液按1：1比例混匀（专用的菌种冻存管），—20度保存。
3、每次使用于冰上操作，动作要快。
另外小量分装冻存，避免反复冻融影响细菌质量。

六细菌保存于含有甘油的培养物中：
1>：在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇－干冰或液氮中冻结后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。
2>：在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库