核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

试剂等
电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板（数套）、鲨鱼齿（67空，数条）、边条（数对）、加样枪（1ml、5ml、10μl、100μl、200μl）、脱色摇床、合适大小的托盘数个
95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷和亲和硅烷（鼎国）、10% APS（过硫酸铵）（液体状试剂一周内有效）、TEMED、40%丙烯酰胺（19:1，上海生工）、尿素（进口，amresco），未注明的均为国产分析纯试剂

试剂配制
亲和硅烷：加10μl Bind-Silane（亲和硅烷）于1ml含10μl醋酸的95%乙醇中，混匀后备用。（涂玻璃板用）
固定/脱色液：10%乙醇，蒸馏水配置（可重复用）
硝化液：15ml硝酸/L蒸馏水
染色液：1g AgNO3/L蒸馏水
显色液：30 g Na2CO3/L蒸馏水（温度不可高，否则显色背景深；可预冷，预冷后可延长显色时间，有助于减轻显色背景，一般情况时室温即可，显色约需3～5min）
终止显色液：10%冰醋酸
电泳用的TAE用蒸馏水配制，制胶用的所有试剂均用双蒸水配制。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
制胶及电泳
（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。
1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）
2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）
3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）
4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）
5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。
（2）制胶：称取尿素21g，加入17ml双蒸水加热约二三十秒溶解，待冷却后加入10ml 5×TBE，冰浴至冰手时加入7.5ml 40%丙烯酰胺（19:1），然后加入225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，快速混匀，准备灌胶。
（3）灌胶：用5ml加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加入到胶板玻璃板之间的空隙，注意不能在胶中形成气泡（要多次实验以掌握技巧、控制加样速度、调节玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、便轻敲变加样等）。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右（不可过深，以免后面不能加样；也不可过浅，以免上样量过小），同时防止梳齿平端下方出现气泡，于室温下静置2h，使胶完全聚合后使用。
（4）预电泳：撕去胶布，两端平行用力拔出梳齿，将玻璃板和梳齿上的多余凝胶擦洗干净，用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。将玻璃板装到电泳槽上，在下方电泳槽中加入1×TBE至没过玻璃板下端约1cm，装好电泳槽，加入1×TBE至没过玻璃板上端约1.5cm处，用梳齿刮去玻璃板间隙间的碎胶，再用5ml加样枪将其吹干净，反转梳齿，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，并用夹子夹紧，梳齿间空隙即为加样孔。120w恒功率，预电泳30min。
（5）点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将梳齿间隙间油状液体吸干净，以利于样品更好的沉降。把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl的扩增产物。
（6）电泳：140-160w恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处时（大约需要1.5~2h），终止电泳，回收电泳液（可重复用一段时间，当发现电压下降很多时要更换电泳液，或者补加蒸馏水可继续用一段时间），取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，凝胶留在长玻璃板上。
银染
（1）固定（脱色）：在托盘1中加入1L固定/脱色液，将有胶的玻璃板胶面向上放入托盘中，置于脱色摇床上低速摇6～10min。
（2）洗胶：在托盘2中用1L蒸馏水漂洗凝胶约10s。
（3）硝化：在托盘3中用1L硝化液硝化凝胶5min。
（4）洗胶：继续在托盘2中漂洗凝胶10s。
（5）染色：在托盘4内加入1L染色液，将胶板放入托盘中低速摇15min。
（6）显影：从染色液中取出胶板，立即将胶板置于显色液中低速摇至显色，直至胶上所有的条带都出现。
（7）定影（终止显色）：从显影液中取出胶板放入终止液中约1min以终止显色。
（8）洗胶：将胶板置于自来水下冲洗正反面直至干净。
（9）干胶：室温下自然干燥，记录实验结果，并用扫描仪或相机记录结果。